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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/101

Title: Abordagem polifásica na caracterização e selecção de bactérias do ácido láctico de vinhos da Região Demarcada do Douro
Authors: Inês, António Francisco Henrique
Advisor: Faia, Arlete Mendes
Tenreiro, José
Issue Date: 2007
Description: Dissertação de Doutoramento em Microbiologia
Abstract: Esta dissertação insere-se no âmbito do tema complexo da selecção de culturas bacterianas ‘starters’ para a realização da fermentação malolática (FML). Neste contexto, o trabalho realizado consistiu na caracterização fenética e funcional de uma colecção de bactérias do ácido láctico (BAL) isoladas de vinhos tintos da Região Demarcada do Douro (RDD), que sofreram a FML espontânea, com o objectivo de seleccionar estirpes autóctones que pudessem ser usadas como ‘starters’ melhor adaptadas ao processo de vinificação. Numa abordagem polifásica, e de acordo com uma estratégia de agrupamento e selecção sequencial de estirpes, foram aplicados métodos fenotípicos e moleculares para avaliação da diversidade fenética da colecção de BAL e para caracterização de um subconjunto de isolados, representativo desta diversidade e com perfil de actividades enzimáticas de interesse enológico. No decorrer deste trabalho foi isolada uma colecção de 793 BAL a partir de 193 amostras de vinho tinto recolhidas em 18 adegas da RDD, em três vindimas consecutivas (1999-2001). Oenococcus foi o género dominante, com 90,6% dos isolados pertencentes a este género, 6,2% pertencentes ao género Lactobacillus e 3,2% a Pediococcus. Para redução do número de isolados em estudo foi seleccionada, de forma aleatória, uma amostra de 295 isolados, representativa da colecção original. Na caracterização fenética destes isolados foram aplicados métodos quimiotaxonómicos e moleculares de tipificação (análise de perfis de proteínas celulares totais e M13-PCR ‘fingerprinting’), para a definição de ‘clusters’ a níveis de semelhança elevados e selecção de estirpes representativas da diversidade subjacente. Em resultado da análise dos perfis de proteínas celulares totais foram seleccionados 227 isolados para tipificação genómica por M13-PCR ‘fingerprinting’. De acordo com a análise dos perfis de ‘fingerprinting’ destes isolados foi possível seleccionar 96 estirpes representantes da diversidade fenética da colecção para identificação a nível de espécie por análise de rDNA 16S. A análise dos perfis de 16S-ARDRA destas estirpes permitiu a identificação de 17 restritipos e a selecção de representantes para sequenciação de rDNA 16S. A identificação a nível de espécie foi realizada por comparação das sequências parciais obtidas com as disponíveis em bases de dados e por análise integrada com os resultados de 16S-ARDRA. Os 295 isolados de BAL foram identificados nas seguintes espécies: Oenococcus oeni (227); Leuconostoc mesenteroides (2); Lactobacillus mali (19); Lactobacillus brevis (11); Lactobacillus plantarum/paraplantarum (6); Lactobacillus vaccinostercus (3); Lactobacillus casei/paracasei/zeae (2); Lactobacillus hilgardii (1); e Pediococcus parvulus (24). A diversidade fenética da colecção de BAL em estudo foi estimada pela aplicação de índices de diversidade que, globalmente, apontaram para a existência de uma diversidade elevada deestirpes de BAL associadas ao processo de produção de vinhos tintos com FML espontânea na RDD, em particular para a espécie Oenococcus oeni. Para a caracterização funcional da diversidade subjacente foram estudadas actividades enzimáticas com relevância enológica, tendo sido efectuado o ‘screening’ da colecção de 295 isolados de BAL para a presença da enzima maloláctica, de ß-glucosidases, das enzimas da via de degradação da arginina, da descarboxilase de tirosina e da descarboxilase de histidina. Com base na análise integrada dos dados provenientes deste ‘screening’ fenotípico e da caracterização fenética dos isolados, seleccionou-se um conjunto de 81 estirpes com características enológicas desejáveis (mle+, ß-glu+, arg-, tdc-, hdc-) representantes da diversidade de cada espécie presente na colecção de BAL em estudo. Para este subconjunto de estirpes procedeu-se à detecção por PCR dos genes associados para confirmação dos resultados do ‘screening’ fenotípico. Para avaliar o comportamento funcional das estirpes seleccionadas pelos ‘screenings’ fenotípico e genotípico, caracterizou-se o seu crescimento em vinho e meios de cultura. As 63 estirpes caracterizadas nestes ensaios foram agrupadas em 6 ‘clusters’ distintos e, ainda que se tenham observado diferenças na distribuição das estirpes de cada sub-região, não se detectou qualquer associação significativa, indicando assim que a diversidade fisiológica das estirpes de BAL responsáveis pela FML espontânea não parece evidenciar qualquer padrão geográfico a nível interno da RDD. Paralelamente, efectuou-se uma caracterização das 41 estirpes de O. oeni, por análise de macrorestrição, para definição do grupo genómico respectivo. Estas estirpes foram agrupadas de acordo com 13 grupos genómicos distintos, tendo o grupo genómico prevalente sido detectado nas três sub-regiões da RDD. De acordo com o objectivo principal desta dissertação, e na sequência da estratégia adoptada, procedeu-se à selecção do subconjunto final de estirpes de O. oeni da RDD que, sendo representativas desta região de produção, possam constituir uma “carteira” de ‘starters’ regionais para FML controlada. Apesar de não ter sido possível caracterizar o comportamento das 17 estirpes seleccionadas em ensaios de transcrição em vinho e meios de cultura, os resultados apresentados, ainda que obtidos a partir de ensaios preliminares, revelam a importância da realização destes estudos na avaliação do comportamento transcricional de genes que codificam para enzimas com relevância enológica. Esta avaliação deverá ser considerada como critério na selecção de estirpes para culturas ‘starter’.
This thesis arises in the scope of the complex subject of the selection of bacterial starter cultures for the accomplishment of malolactic fermentation (MLF). Under the main goal of selecting autochthone strains better adapted to the winemaking process, the work involved the phenetic and functional characterization of a collection of lactic acid bacteria (LAB) isolated from red wines of the Demarcated Region of Douro (RDD), which had undergone spontaneous MLF. Following a narrow-down strategy of grouping and sequential selection of strains in a poliphasic approach, phenotypic and molecular methods were applied both to evaluate the phenetic diversity of the BAL collection and to characterize a subgroup of strains, representative of this diversity and with a profile of enzymatic activities oenologically relevant. In the course of this work, a collection of 793 BAL was isolated from 193 samples of red wine collected in 18 wineries of the RDD, in three consecutive vintages (1999-2001). Oenococcus was the dominant genus (90.6%), followed by Lactobacillus (6.2%) and Pediococcus (3.2%). To decrease the number of isolates under in study, 295 isolates were selected as a representative sample. A phenetic characterization of these 295 isolates, based on chemotaxonomic and molecular methods of strain typing (whole-cell protein profiling and M13-PCR fingerprinting), was applied for clustering and selection of a set of strains representative of the underlying diversity. Analysis of the whole-cell protein profiles allowed the selection of 227 isolates for genomic typing by M13-PCR fingerprinting. According to the M13-PCR fingerprinting results, 96 strains representative of the phenetic diversity of the BAL collection were selected for identification at species level. The analysis of 16S-ARDRA profiles for these strains allowed the identification of 17 restritypes and the selection of representatives strains for 16S rDNA sequencing. The identification at the species level was performed by comparison of the obtained partial sequences with those available in public databases and by integrated analysis with 16S-ARDRA results. The 295 BAL isolates were identified as belonging to the following species: Oenococcus oeni (227); Leuconostoc mesenteroides (2); Lactobacillus mali (19); Lactobacillus brevis (11); Lactobacillus plantarum/paraplantarum (6); Lactobacillus vaccinostercus (3); Lactobacillus casei/paracasei/zeae (2); Lactobacillus hilgardii (1); and Pediococcus parvulus (24). The evaluation of the phenetic diversity of the BAL collection under study was performed with diversity indexes, that globally pointed to the existence of a high diversity of BAL strains associated with spontaneous MLF of red wines in RDD, in particular for the species Oenococcus oeni. For the functional characterization of the underlying diversity, the collection of 295 BAL was screened for enzymatic activities with oenological relevance: the presence of malolactic enzyme, β-glucosidases, enzymes involved in arginine degradation pathway, tyrosine decarboxylase and histidine decarboxylase. The integrated analysis of the data from this phenotypic screening and previous phenetic characterization allowed the selection of a set of 81 strains with desirable oenological characteristics (mle+, β-glu+, arg-, tdc-, hdc-), representative of the intra-specific diversity of the BAL collection. Confirmation of phenotypic screening results was performed for this subset of strains, through PCR detection of genes associated with the targeted phenotypes. The functional behavior of the strains selected by both phenotypic and genotypic screenings was evaluated by growth in wine and culture media. The 63 strains characterized in these assays were grouped in 6 distinct clusters and, although differences in strain distribution have been observed, they did not correlate with sub-regions. This fact indicates that the physiological diversity of BAL strains responsible for the spontaneous FML does not seem to follow any geographic pattern at an internal level in RDD. In parallel, the genomic groups of 41 O. oeni strains were assessed by macrorestriction analysis. These strains were grouped in 13 different genomic groups, and the most prevalent group was detected in the three sub-regions of RDD. In accordance with the main goal of this thesis, and in sequence with the adopted strategy, a group of O. oeni strains from RDD was selected as representative of this region of production to constitute a "regional wallet" of starters for controlled FML. Although it has not been possible to characterize the behavior of the 17 selected strains in transcription assays in wine and culture media, the results presented, though obtained in preliminary assays, disclose the importance of the accomplishment of these studies in the evaluation of the transcriptional behavior of genes that codify for enzymes with oenological relevance. This evaluation should be considered as an additional criterion in the selection of strains for starter cultures.
Keywords: Fermentação maloláctica
Bactérias do ácido láctico
Macrorestrição
Aminas biogénicas
URI: http://hdl.handle.net/10348/101
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