Neutrophil Extracellular Traps in Bacterial Meningitis: A novel therapeutic target for treatment.
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2018-02-28
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Resumo
Streptococcus pneumoniae bacterial meningitis is currently a high impact disease with a mortality rate of 30% and survivors are highly prone to sequelae. Bacterial meningitis is a bacterial infection of the central nervous system (CNS) that results in inflammation of the protective fluid-filled layer, called the meninges, that envelops the brain and spinal cord. The diagnosis of acute bacterial meningitis (ABM) is a major problem due to the difficulty to discern it from viral meningitis (VM) at disease onset. Neutrophils are the first immune cells to react to an infection and they play a primary role in the organism’s response to invading pathogens. Neutrophil extracellular trap (NET) formation, or NETosis, is a process in which neutrophils release a web-like structure to the extracellular space, composed of a DNA backbone and antimicrobial proteins in order to ensnare and kill pathogens. Previous research in our group found that NETs are present specifically in bacterial meningitis patient samples but not in other forms of meningitis or trauma. Since NETs are known to trap and kill bacteria we therefore hypothesize in this study that NETs in the cerebrospinal fluid (CSF) influence bacterial killing during meningitis. In order to inspect the role of NETosis in vivo, we developed a rat model of bacterial meningitis using a clinical isolate of S. pneumoniae. Rats with S. pneumoniae meningitis showed a significant increase of NETosis compared to the saline vehicle controls. To determine whether NETs affect bacterial killing in vitro DNase I, an enzyme that dissolves the DNA backbone of NETs, was infused into the meninges of infected rats. DNase I was able to clear NETs from the CSF and also resulted in a significantly decreased bacterial load in the brain. This effect was observed even if DNase I was administered 10 hours after the infection and even if it was administered intravenously. To study the mechanism of this bacterial killing by DNase, we used an in vitro model of NETosis in isolated human neutrophils. First, to determine whether the formation of NETs can be generalized to other types of bacterial meningitis we analyzed the ability of different meningeal pathogen strains to induce NETosis in vitro and determined that most clinically isolated meningeal pathogens were able to induce NETosis. To test whether innate neutrophil killing mechanisms play a role in DNase-mediated bacterial killing, we inhibited neutrophil phagocytosis and oxidative burst using specific inhibitors and found that this almost completely prevented bacterial killing. Assays measuring neutrophil oxidative burst and phagocytosis also indicated that these processes are increased in the presence of DNase. Our results indicate that NET formation hinders the clearance of bacterial infection. Treatment with DNase I promotes other innate neutrophil bacterial killing mechanisms. DNase I as well as other NET disrupting compounds might be a potential target for therapeutic treatment of bacterial meningitis. In the future detection of NETosis could be a good way to diagnose early bacterial meningitis discerning it from viral meningites.
Meningite causada por Streptococcus pneumoniae é actualmente uma doença com forte impacto global e uma percentagem de mortalidade de 30% cujos sobreviventes são muito propensos a sequelas. Meningite bacteriana é uma infecção do sistema nervoso central, que resulta na inflamação das meninges que envolvem o cérebro e a espinal medula. O diagnóstico para a meningite bacteriana é um problema devido à dificuldade de a distinguir da meningite viral durante a fase inicial da doença. Os neutrófilos desempenham um papel importante na resposta do organismo contra agentes patogénicos. O processo de formação de “neutrophil extracellular trap” (NET), também designado NETosis, é um processo no qual os neutrófilos libertam uma estrutura em forma de rede para o espaço extracelular. Estas estruturas são compostas por uma base de DNA e proteínas antimicrobianas, de forma a capturar e eliminar bactérias. Experiências anteriores realizadas pelo nosso grupo identificaram NETs exclusivamente em meningite bacteriana, dentro dos diferentes tipos de meningite. Uma vez que os NETs são reconhecidos pela captura e eliminação de agentes patogénicos, foi formulada a hipótese de que os NETs são importantes no líquido cefalorraquidiano (LCR) para eliminar agentes infecciosos durante meningite. Para averiguar o papel da NETosis in vivo foi desenvolvido um modelo animal de meningite bacteriana. Ratos infectados revelaram um aumento significativo de NETosis comparado com os controlos de soro fisiológico. Para determinar se os NETs afectam a eliminação de agentes patogénicos in vitro, uma enzima que dissolve a base de DNA dos NETs (DNase I) foi administrada nas meninges dos animais infectados. A enzima foi capaz de dissolver os NETs presentes no LCR, resultando num decréscimo significativo da carga bacteriana presente no cérebro. O mesmo efeito foi observado na administração de DNase 10 horas após infecção e na administração da enzima por via intravenosa. Para investigar o mecanismo pelo qual a DNase elimina o agente patogénico foi usado um modelo in vitro de NETosis. Primeiro de forma a determinar se a formação de NETs pode ser generalizada a outros tipos de estirpes de meningite bacteriana, nós analisamos a capacidade de diferentes agentes patogénicos para induzir NETosis in vitro. A maioria das estirpes de meningite bacteriana foram capazes de induzir NETosis. Para testar se os neutrófilos estariam a usar outros mecanismos para eliminar bactérias ajudando na eliminação de bactérias observadas com DNase, inibimos os processos de fagocitose e de eliminação por espécies reactivas de oxigénio (ROS). Descobrimos que os inibidores preveniam quase completamente a eliminação das bactérias. A medição do processo de eliminação de bactérias através dos ROS e de fagocitose demonstraram que existe um aumento na sua concentração na presença de DNase. Os nossos resultados indicam que a formação de NETs dificulta a eliminação da infecção bacteriana nas meninges. Tratamento com DNase promove outros mecanismos dos neutrófilos para a eliminação do agente infeccioso. A DNase como outros compostos capazes de dissolverem NETs poderão vir a ser um alvo para tratamentos terapêuticos. No futuro a detecção de NETosis poderá vir a ser uma excelente maneira de diagnosticar meningite bacteriana numa fase mais inicial.
Meningite causada por Streptococcus pneumoniae é actualmente uma doença com forte impacto global e uma percentagem de mortalidade de 30% cujos sobreviventes são muito propensos a sequelas. Meningite bacteriana é uma infecção do sistema nervoso central, que resulta na inflamação das meninges que envolvem o cérebro e a espinal medula. O diagnóstico para a meningite bacteriana é um problema devido à dificuldade de a distinguir da meningite viral durante a fase inicial da doença. Os neutrófilos desempenham um papel importante na resposta do organismo contra agentes patogénicos. O processo de formação de “neutrophil extracellular trap” (NET), também designado NETosis, é um processo no qual os neutrófilos libertam uma estrutura em forma de rede para o espaço extracelular. Estas estruturas são compostas por uma base de DNA e proteínas antimicrobianas, de forma a capturar e eliminar bactérias. Experiências anteriores realizadas pelo nosso grupo identificaram NETs exclusivamente em meningite bacteriana, dentro dos diferentes tipos de meningite. Uma vez que os NETs são reconhecidos pela captura e eliminação de agentes patogénicos, foi formulada a hipótese de que os NETs são importantes no líquido cefalorraquidiano (LCR) para eliminar agentes infecciosos durante meningite. Para averiguar o papel da NETosis in vivo foi desenvolvido um modelo animal de meningite bacteriana. Ratos infectados revelaram um aumento significativo de NETosis comparado com os controlos de soro fisiológico. Para determinar se os NETs afectam a eliminação de agentes patogénicos in vitro, uma enzima que dissolve a base de DNA dos NETs (DNase I) foi administrada nas meninges dos animais infectados. A enzima foi capaz de dissolver os NETs presentes no LCR, resultando num decréscimo significativo da carga bacteriana presente no cérebro. O mesmo efeito foi observado na administração de DNase 10 horas após infecção e na administração da enzima por via intravenosa. Para investigar o mecanismo pelo qual a DNase elimina o agente patogénico foi usado um modelo in vitro de NETosis. Primeiro de forma a determinar se a formação de NETs pode ser generalizada a outros tipos de estirpes de meningite bacteriana, nós analisamos a capacidade de diferentes agentes patogénicos para induzir NETosis in vitro. A maioria das estirpes de meningite bacteriana foram capazes de induzir NETosis. Para testar se os neutrófilos estariam a usar outros mecanismos para eliminar bactérias ajudando na eliminação de bactérias observadas com DNase, inibimos os processos de fagocitose e de eliminação por espécies reactivas de oxigénio (ROS). Descobrimos que os inibidores preveniam quase completamente a eliminação das bactérias. A medição do processo de eliminação de bactérias através dos ROS e de fagocitose demonstraram que existe um aumento na sua concentração na presença de DNase. Os nossos resultados indicam que a formação de NETs dificulta a eliminação da infecção bacteriana nas meninges. Tratamento com DNase promove outros mecanismos dos neutrófilos para a eliminação do agente infeccioso. A DNase como outros compostos capazes de dissolverem NETs poderão vir a ser um alvo para tratamentos terapêuticos. No futuro a detecção de NETosis poderá vir a ser uma excelente maneira de diagnosticar meningite bacteriana numa fase mais inicial.
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Palavras-chave
Neutrophil extracellular Traps , meningite bacteriana