Layer-by-Layer coated microparticle templates for biomedical applications
Data
2019-01-29
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Resumo
Over the last decades there has been a great interest in the design and development of nanoand microscale drug delivery systems for the encapsulation, protection, and sustained and targeted delivery of therapeutics at injured sites, as well as for triggering the regeneration of specific tissues and/or organs. Among them, polymeric microparticles and microcapsules produced by using natural and/or synthetic polymers, as well as surface engineering approaches have emerged owing to their intriguing features, including large surface area, easy and versatile surface functionalization, and tunable physicochemical properties. In particular, particles and capsules developed by resorting to natural-origin polymers have attracted massive attention in the biomedical field due to their biocompatibility, biodegradability and wide bioavailability. Nevertheless, some synthetic polymers have been also used in the biomedical arena owing to their promising features. For instance, poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) is one of the most attractive synthetic polymers due to its biocompatibility, biodegradability, and easily tunability, being already approved by the regulatory authorities to be used in the clinics. Concomitantly, PLGA-based drug carriers have shown to not elicit biological risk upon cellular uptake. In this work, two distinct microparticle templates were produced and surface functionalized with polymeric materials via the bottom-up Layer-by-Layer (LbL) assembly technology to assess the sustained released of model compounds or their cellular uptake. As such, polymeric PLGAbased microparticles were produced, loaded with a model hydrophobic compound with fluorescent features, namely coumarin 6 (C6), and further surface-functionalized via the Layerby-Layer (LbL) assembly of oppositely charged poly-L-lysine (PLL) and alginate (ALG) polymers, to assess the influence of the number of layers on the sustained release of C6. The encapsulation efficiency and the in vitro release profile were assessed and quantified by fluorescence spectroscopy, confirming the sustained release upon 21 days. The role of some of the most relevant physicochemical properties of the particles, known to have a significant impact on the interaction with biological systems, including the mean particle size and surface charge was evaluated. Following this study, hollow polysaccharide-based microcapsules were produced by alternate deposition of chitosan (CHT) and ALG multilayers onto calcium carbonate (CaCO3) microparticles surface, followed by core template dissolution. The mean particle size, surface charge, and aggregation tendency were evaluated aiming to produce welldispersed microcapsules. The in vitro cellular uptake of aggregated and well-dispersed microcapsules was assessed by confocal laser scanning microscopy using mouse lung fibroblast cell line (L929), proving that, in opposition to the aggregated microcapsules, the well-dispersed microcapsules were successfully internalized by cells and, very importantly, the cells remained viable. In both systems, the morphological properties of the particles/capsules were assessed by advanced microscopy techniques, including scanning and transmission electron microscopy, as well as widefield fluorescence microscopy.
Ao longo dos anos, em especial nas últimas décadas, o interesse pelo desenvolvimento de sistemas à nano e microescala para encapsulamento, proteção e distribuição controlada e direcionada de agentes terapêuticos em locais alvo, bem como para desencadear a regeneração de tecidos específicos e/ou órgãos tem aumentado consideravelmente. Entre eles, micropartículas e microcápsulas de origem polimérica produzidas com recurso a polímeros naturais e/ou sintéticos, bem como a técnicas de engenharia de superfície, emergiram devido às suas importantes caraterísticas, incluindo grande área de superfície, funcionalização simples e versátil da sua superfície e propriedades físico-químicas facilmente ajustáveis. Em particular, partículas e cápsulas desenvolvidas com recurso a polímeros de origem natural têm atraído grande atenção por parte da comunidade científica a desenvolver a sua atividade de investigação no campo da biomedicina devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e ampla biodisponibilidade. No entanto, alguns polímeros sintéticos também têm sido utilizados devido às suas caraterísticas promissoras. Por exemplo, o poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA, do inglês poly(lactic-co-glycolic) acid) é um dos polímeros sintéticos mais atrativos devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e fácil manipulação, estando aprovado pelas autoridades reguladoras para uso clínico. Simultaneamente, sistemas de libertação e transporte de fármacos fabricados à base de PLGA tem demonstrado não provocar qualquer tipo de risco biológico após a sua internalização celular. Neste trabalho, dois modelos distintos de micropartículas foram produzidos e funcionalizados superficialmente com materiais poliméricos com recurso à tecnologia de deposição camada-a-camada (LbL, do inglês Layerby-Layer) afim de avaliar a libertação controlada de compostos modelo bem como a sua internalização celular. Como tal, foram produzidas micropartículas poliméricas à base de PLGA, incorporando um composto modelo hidrofóbico e fluorescente, nomeadamente a cumarina 6 (C6, do inglês coumarin 6), e posteriormente a sua superfície foi funcionalizada através da tecnologia de LbL com multicamadas poliméricas, utilizando para tal poli-L-lisina (PLL, do inglês poly-L-lysine) e alginato (ALG, do inglês alginate), polímeros de carga oposta, para avaliar a influência do número de camadas na libertação controlada de C6. A eficiência de encapsulamento e o perfil de libertação in vitro foram avaliados e quantificados via espetroscopia de fluorescência, confirmando uma libertação controlada após 21 dias. O papel de algumas das propriedades físico-químicas mais relevantes das partículas, conhecidas por induzir um impacto significativo na interação com os sistemas biológicos, incluindo o tamanho médio das partículas e a sua carga superficial foram avaliadas. Após este estudo, microcápsulas ocas à base de polissacarídeos foram produzidas por deposição alternada de multicamadas de quitosano (CHT, do inglês chitosan) e ALG sobre a superfície das micropartículas de carbonato de cálcio (CaCO3, do inglês calcium carbonate), seguido da dissolução do seu core. O tamanho médio das partículas, a carga de superficial e a tendência para agregarem foram avaliados visando produzir microcápsulas bem dispersas. A internalização celular in vitro das microcápsulas agregadas e dispersas foi estudada por microscopia de confocal de varrimento a laser, recorrendo a uma linha celular de fibroblastos de pulmão de rato (L929). Ao invés do observado com as microcápsulas agregadas, as microcápsulas dispersas foram internalizadas com sucesso pelas células, que por sua vez permaneceram viáveis ao longo do tempo. Em ambos os sistemas, as propriedades morfológicas das partículas/cápsulas foram avaliadas por técnicas avançadas de microscopia, incluindo microscopia eletrónica de varrimento e de transmissão, bem como por microscopia de fluorescência de campo amplo
Ao longo dos anos, em especial nas últimas décadas, o interesse pelo desenvolvimento de sistemas à nano e microescala para encapsulamento, proteção e distribuição controlada e direcionada de agentes terapêuticos em locais alvo, bem como para desencadear a regeneração de tecidos específicos e/ou órgãos tem aumentado consideravelmente. Entre eles, micropartículas e microcápsulas de origem polimérica produzidas com recurso a polímeros naturais e/ou sintéticos, bem como a técnicas de engenharia de superfície, emergiram devido às suas importantes caraterísticas, incluindo grande área de superfície, funcionalização simples e versátil da sua superfície e propriedades físico-químicas facilmente ajustáveis. Em particular, partículas e cápsulas desenvolvidas com recurso a polímeros de origem natural têm atraído grande atenção por parte da comunidade científica a desenvolver a sua atividade de investigação no campo da biomedicina devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e ampla biodisponibilidade. No entanto, alguns polímeros sintéticos também têm sido utilizados devido às suas caraterísticas promissoras. Por exemplo, o poli(ácido lático-co-glicólico) (PLGA, do inglês poly(lactic-co-glycolic) acid) é um dos polímeros sintéticos mais atrativos devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e fácil manipulação, estando aprovado pelas autoridades reguladoras para uso clínico. Simultaneamente, sistemas de libertação e transporte de fármacos fabricados à base de PLGA tem demonstrado não provocar qualquer tipo de risco biológico após a sua internalização celular. Neste trabalho, dois modelos distintos de micropartículas foram produzidos e funcionalizados superficialmente com materiais poliméricos com recurso à tecnologia de deposição camada-a-camada (LbL, do inglês Layerby-Layer) afim de avaliar a libertação controlada de compostos modelo bem como a sua internalização celular. Como tal, foram produzidas micropartículas poliméricas à base de PLGA, incorporando um composto modelo hidrofóbico e fluorescente, nomeadamente a cumarina 6 (C6, do inglês coumarin 6), e posteriormente a sua superfície foi funcionalizada através da tecnologia de LbL com multicamadas poliméricas, utilizando para tal poli-L-lisina (PLL, do inglês poly-L-lysine) e alginato (ALG, do inglês alginate), polímeros de carga oposta, para avaliar a influência do número de camadas na libertação controlada de C6. A eficiência de encapsulamento e o perfil de libertação in vitro foram avaliados e quantificados via espetroscopia de fluorescência, confirmando uma libertação controlada após 21 dias. O papel de algumas das propriedades físico-químicas mais relevantes das partículas, conhecidas por induzir um impacto significativo na interação com os sistemas biológicos, incluindo o tamanho médio das partículas e a sua carga superficial foram avaliadas. Após este estudo, microcápsulas ocas à base de polissacarídeos foram produzidas por deposição alternada de multicamadas de quitosano (CHT, do inglês chitosan) e ALG sobre a superfície das micropartículas de carbonato de cálcio (CaCO3, do inglês calcium carbonate), seguido da dissolução do seu core. O tamanho médio das partículas, a carga de superficial e a tendência para agregarem foram avaliados visando produzir microcápsulas bem dispersas. A internalização celular in vitro das microcápsulas agregadas e dispersas foi estudada por microscopia de confocal de varrimento a laser, recorrendo a uma linha celular de fibroblastos de pulmão de rato (L929). Ao invés do observado com as microcápsulas agregadas, as microcápsulas dispersas foram internalizadas com sucesso pelas células, que por sua vez permaneceram viáveis ao longo do tempo. Em ambos os sistemas, as propriedades morfológicas das partículas/cápsulas foram avaliadas por técnicas avançadas de microscopia, incluindo microscopia eletrónica de varrimento e de transmissão, bem como por microscopia de fluorescência de campo amplo
Descrição
Dissertação de Mestrado em Engenharia Biomédica apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Palavras-chave
biocompatible polymers , layer-by-layer assembly , microparticles , hollow multilayered microcapsules , drug delivery , cellular internalization