Evaluation of the effects of glyphosate association with copper, zinc, and manganese metals on zebrafish development

Projetos de investigação
Unidades organizacionais
Fascículo
Resumo
The use of herbicides with glyphosate as an active ingredient (a.i.) has increased dramatically in recent years being currently the most used in the world. Due to its inappropriate use, its residues have often been found in soil and water, raising concerns about its potential harmful effects on ecosystems. Recent data indicate that glyphosate can cause adverse effects in vertebrates, although these have been attributed to the presence of adjuvants in commercial formulations and not to the active ingredient. In any case, the underlying ecotoxicity mechanisms are not fully understood. Thus, the evaluation of the toxic effects of glyphosate in the environment and its impact on humans is a priority in ecotoxicology research. The studies developed in this thesis used the zebrafish (Danio rerio) as an animal model. This species has been frequently used in the evaluation of the toxicity profile of compounds in vivo. Early stages of zebrafish development offer a model that fits within the scope of the 3Rs policy, being an alternative to animal experimentation in biomedical and ecotoxicological research. Thus, in the introduction to this thesis (Chapter I), a literature review of the evidence regarding the toxic effects of pure glyphosate or glyphosate-based herbicide (GBH) on embryonic zebrafish stages was elaborated. There are differences in the literature regarding the toxic effects associated with exposure to glyphosate versus GBHs. Additionally, the impact of exposure to GBHs in the early stages of zebrafish development remains unclear. In order to investigate the lethal and sublethal effects of a GBH exposure on developing zebrafish embryos, a 72 h exposure to Roundup® Ultramax (RU) at concentrations of 2, 5, 8.5 μg a.i. mL−1 was performed. The results of this work are presented in chapter II, in which a 72 h LC50 of 8.53 μg a.i. mL−1 and an increased mortality of embryos exposed to concentrations greater than 8.5 μg a.i. mL−1 were reported, as well as an increase in malformations, changes in heart rate and hatching. At concentrations of 2 and 5 μg a.i. mL−1 , no changes were observed in the histological evaluation, namely teratogenic effects, nor in the biochemical parameters analysed, such as generation of reactive oxygen species (ROS), changes in oxidative stress enzymes (superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione S-transferase (GST), reduced glutathione (GSH), glutathione oxidized (GSSG)), induction of lipid peroxidation (LPO), alteration of acetylcholinesterase (AChE) or lactate dehydrogenase (LDH) activity. The results obtained are suggestive that the toxicological effects on zebrafish are concentration dependent. In chapter III the impact of 72 h exposure to RU at environmentally relevant concentrations (1, 2 and 5 μg a.i. mL−1 ) on different behavioural patterns of zebrafish embryos is reported. Zebrafish embryos were exposed for 72 h and maintained until 144 hpf, when larval behaviour was assessed through general exploratory motility, escape responses, anxiety-related behaviours, social interactions and through the measurement of cortisol levels. Cortisol levels remained similar between treatments, but larvae exposed to 5 μg a.i. mL−1 did not react to the presence of an aversive stimulus, suggesting that RU can induce changes in sensorimotor coordination during zebrafish development, possibly indicative of its neurotoxic effect. Chapter IV presents a study that aimed to evaluate the effects of acute exposure (4 h 30 min) to a commercial formulation of glyphosate, Roundup ® Flex (RF), at concentrations of 1, 5 and 10 μg a.i. mL−1 in Tg(mpxGFP)i114 transgenic and wild-type (WT) zebrafish larvae, with 72 hpf, by evaluating the inflammatory response, oxidative stress, and cell death. None of the concentrations tested induced changes in the number of neutrophils and nitric acid levels. No changes were observed in the activity of antioxidant enzymes SOD, CAT and glutathione peroxidase (GPx), GST, nor in the levels of GSH and GSSG. The results regarding LPO, LDH and AChE were also similar between the groups. However, at a concentration of 10 μg a.i. mL−1 , an increase in ROS levels and cell death was observed. Evidence suggests that toxicological effects are concentration dependent, albeit at concentrations that are not routinely found in the environment. Glyphosate has chelating properties, forming complexes with metal ions, including Cu, Mn and Zn. The synergistic effect between GBH and metals is believed to have a negative impact on ecosystems, however, these mechanisms are currently unclear. To clarify the mechanisms of toxicity involved, in Chapter V the impact of exposure to a GBH (Roundup® Flex) complexed with metals (Copper, Manganese and Zinc) were assessed, during the initial period of zebrafish embryo development (96 hpf). The endpoints of lethal and sublethal development were evaluated. The results showed that metals induced higher levels of toxicity in embryos/larvae, compared to GBH. Cu was able to induce teratogenic effects in the larvae as well as a decrease in CAT activity, an increase in GPx and GST, a reduction in GSH levels and AChE activity, induction of apoptosis and changes in larval behaviour. Zinc increased mortality, ROS levels and SOD activity, and caused a decrease in AChE activity. Manganese increased the activity of SODs enzymes. The combination of GBH/metal also showed teratogenic effects during their development but in smaller proportions than the metal alone. Although more studies are needed, the results suggest that GBH may interfere with mechanisms of metal toxicity in zebrafish. Finally, in Chapter VI, the general conclusions of the studies performed in this thesis on the toxic effects associated with exposure to GBHs in zebrafish embryos and their potential impacts on ecosystems are explored. Possible directions for future research in this area are also proposed.
O uso de herbicidas com glifosato como ingrediente ativo (i.a.) aumentou dramaticamente nos últimos anos, sendo atualmente dos mais utilizados no mundo. Devido ao seu uso inadequado, os seus resíduos têm sido frequentemente encontrados no solo e água, levantando questões sobre os potenciais efeitos prejudiciais para os ecossistemas. Dados recentes sugerem que o glifosato pode causar efeitos adversos em vertebrados, embora estes tenham sido atribuídos à presença de coadjuvantes nas formulações comerciais e não apenas ao ingrediente ativo. Os mecanismos de ecotoxicidade subjacentes ainda não estão totalmente esclarecidos. Assim, a avaliação dos efeitos tóxicos do glifosato no meio ambiente e a sua repercussão no ser humano é uma prioridade na investigação em ecotoxicologia. Os estudos desenvolvidos nesta tese recorreram ao peixe-zebra (Danio rerio) como modelo animal. Esta espécie tem sido frequentemente utilizada na avaliação do perfil de toxicidade de diferentes compostos in vivo. As fases iniciais do desenvolvimento do peixe-zebra constituem um modelo que se enquadra no âmbito da política dos 3Rs e são uma alternativa à experimentação animal em investigação biomédica e ecotoxicológica. Assim, na introdução da presente tese (capítulo I), foi elaborada uma revisão da bibliografia que refere os efeitos tóxicos do glifosato puro ou de herbicidas à base de glifosato (GBH) no peixe-zebra, em fases embrionárias. Na literatura constatam-se divergências quanto aos efeitos tóxicos associados à exposição ao glifosato versus GBHs. Adicionalmente, o impacto da exposição aos GBHs nos estágios iniciais do desenvolvimento do peixe-zebra permanecem pouco esclarecidos. Com o objetivo de investigar os efeitos letais e subletais da exposição a um GBH no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, foi realizada uma exposição durante 72 h ao Roundup® Ultramax (RU) nas concentrações de 2, 5, 8,5 μg a.i. mL−1 . Os resultados deste trabalho são apresentados no capítulo II, no qual foi relatado um valor de LC50, às 72 h, de 8,53 μg a.i. mL−1 , um aumento da mortalidade nos embriões expostos a concentrações superiores a 8,5 μg a.i. mL−1 , bem como um aumento de malformações, alterações na frequência cardíaca e na taxa de eclosão. Nas concentrações de 2 e 5 μg a.i. mL−1 , não se observaram alterações na avaliação histológica, nomeadamente efeitos teratogénicos, nem nos parâmetros bioquímicos analisados, como geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), alterações nas enzimas de stress oxidativo (superoxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa S-transferase (GST), glutationa reduzida (GSH), glutationa oxidada (GSSG)), indução de peroxidação lipídica (LPO), alteração da atividade da acetilcolinesterase (AChE) ou da lactato desidrogenase (LDH). Os resultados obtidos são sugestivos de que os efeitos toxicológico no peixe zebra é dependente da concentração. No capítulo III foi avaliado o impacto da exposição à mesma formulação comercial de glifosato (RoundUp® UltraMax), em concentrações ambientalmente relevantes (1, 2 e 5 μg a.i. mL−1 ), em diferentes parâmetros comportamentais dos embriões de peixe-zebra. Estes foram expostos durante 72 h (de 2,5 a 75 h pós-fertilização (hpf)) e mantidos até 144 hpf, momento em que o comportamento das larvas foi avaliado através da avaliação da motilidade exploratória geral, respostas de fuga, comportamentos associados à ansiedade, interações sociais e também através do doseamento dos níveis de cortisol. Os níveis de cortisol permaneceram sobreponíveis entre os tratamentos. As larvas expostas a 5 μg a.i. mL−1 não reagiram à presença de um estímulo aversivo, sugerindo que RU possa induzir alterações na coordenação sensitivo-motora durante o desenvolvimento do peixe-zebra, possivelmente indicativo do seu efeito neurotóxico. O estudo apresentado no capítulo IV teve como objetivo avaliar os efeitos da exposição aguda (4 h 30 min) a uma formulação comercial de glifosato, Roundup® Flex (RF), em concentrações de 1, 5 e 10 μg a.i. mL−1 em larvas de peixe-zebra Tg(mpxGFP)i114 transgénico e tipo selvagem (WT), com 72 hpf, através da avaliação da resposta inflamatória, de indução de stresse oxidativo e morte celular. Nenhuma das concentrações testadas induziu alterações no número de neutrófilos e níveis de ácido nítrico (NO). Não foram observadas alterações na atividade de enzimas antioxidantes SOD, CAT e glutationa peroxidase (GPx), GST, nem os níveis GSH e GSSG. Os resultados relativamente aos níveis de LPO, e atividade da LDH e AChE também foram semelhantes entre os grupos. Porém, na concentração de 10 μg a.i. mL−1 , foi observado um aumento dos níveis de ROS e da morte celular. As evidências sugerem que os efeitos toxicológicos são dependentes da concentração, embora em concentrações que não são rotineiramente detectadas no ambiente. O glifosato possui propriedades quelantes, formando complexos com iões metálicos, nomeadamente Cu, Mn e Zn. Acredita-se que o efeito sinérgico entre GBH e metais tenha um impacto negativo nos ecossistemas, mas esses mecanismos ainda não estão clarificados. Para contribuir para o esclarecimento dos mecanismos de toxicidade envolvidos, no Capítulo V são relatados os resultados da avaliação do impacto da exposição a um GBH (Roundup® Flex) complexado com metais (Cobre, Manganês e Zinco), em concentrações ambientalmente relevantes, durante o período inicial do desenvolvimento embrionário do peixe-zebra (96 hpf), onde foram avaliados endpoints do desenvolvimento letal e subletal. Os resultados mostraram que os metais induziram maiores níveis de toxicidade no peixe-zebra, comparativamente ao GBH. O Cu foi capaz de induzir efeitos teratogénicos nas larvas bem como a diminuição da atividade da CAT, aumento da atividade das enzimas GPx e GST, redução dos niveis de GSH e da atividade da AChE, a indução de apoptose e de alterações no comportamento das larvas. O zinco aumentou a mortalidade, os níveis de ROS e a atividade das SODs e causou uma diminuição na atividade da AChE. O manganês aumentou a atividade das enzimas SODs. Os embriões expostos à combinação de GBH/Metal também apresentaram efeitos teratogénicos durante seu desenvolvimento, mas em proporções menores do que os metais isoladamente. Embora mais estudos sejam necessários, os resultados sugerem que o GBH pode interferir nos mecanismos de toxicidade dos metais no peixe zebra. Por fim, no capítulo VI são exploradas as conclusões gerais dos estudos contemplados na presente tese, sobre os efeitos tóxicos associados à exposição a GBHs em embriões e larvas de peixe-zebra e os seus potenciais impactos nos ecossistemas em que estes se inserem. São igualmente propostas possíveis orientações para futura investigação nesta área.
Descrição
PhD thesis in Chemical and Biological Sciences
Palavras-chave
Behaviour , Glyphosate
Citação