Development, validation and implementation of an NGS gene panel approach for the diagnosis of renal amyloidoses

Data
2022-02-21
Título da revista
ISSN da revista
Título do Volume
Editora
Projetos de investigação
Unidades organizacionais
Fascículo
Resumo
Amyloidosis comprises a group of diseases whose pathogenesis is related with the deposition of amyloid fibrils in organs or tissues, disrupting their function and ultimately, leading to their failure. The different amyloidosis types can vary according to amyloid distribution (localised or systemic) and its origin (acquired or hereditary), both influenced by the precursor protein associated. Each precursor protein can be associated with two forms of distribution and origin, complicating the diagnosis. In fact, currently 36 different proteins can originate amyloid fibrils and their identification is fundamental in order to achieve a correct diagnosis. However, the elevated number of precursor proteins associated and the heterogeneous presentation of the disease often lead to misdiagnosis and incorrect treatments that can endanger patient’s lives. The evolution in amyloidosis diagnosis through the last few years has allowed the detection and treatment of the disease sooner, extending the patient’s survival. This fact is related to the introduction of new methodologies in the diagnostic workflow, such as mass spectrometry, which identifies the precursor protein using biopsy tissue, as well as NGS approaches which detects variants present in DNA extracted from blood, particularly important for genetic counselling of families affected with hereditary amyloidosis. In this dissertation, a new approach to study amyloidosis at CGMJM was developed, employing NGS methodologies, based on the design of a multi-gene panel including genes previously associated with amyloidosis. This approach was an attempt to improve amyloidosis diagnosis efficiency and associated costs, since the current CGMJM routine diagnostic workflow consists in consecutive single-gene analysis by conventional sequencing, which is time and resource consuming. Firstly, the NGS multi-gene panel was tested through double-blind assays, using control samples from patients who were previously molecularly diagnosed (positive controls). The disease-causing variants of the controls’ samples were correctly detected and a good coverage was obtained, enabling the validation of the designed NGS multi-gene panel. Afterwards, the NGS multi-gene panel was employed in DNA samples of genetically uncharacterized patients in an attempt to achieve a molecular diagnosis. Concurrently, in order to complement the study of these patients and apart from the NGS multi-gene panel design, primers targeting genes not previously included in the panel were designed for conventional sequencing, as well as primers to cover regions presenting low coverage using the NGS panel. This new study approach did not result in the detection of variants with reported pathogenicity. However, the amyloidosis NGS multi-gene panel efficiency in variant detection was confirmed. With this work, the availability of the amyloidosis NGS multi-gene panel as a first-tier approach in amyloidosis diagnosis has been demonstrated, enabling several samples sequencing and multiple target genes at the same time, particularly important in this disease associated with several protein precursors, increasing clinical efficiency and reducing diagnosis time and costs.
A amiloidose compreende um grupo de doenças cuja patogénese é devida à deposição de amiloide em órgãos ou tecidos, perturbando a sua função e consequentemente, provocando a sua falência. Os diferentes tipos de amiloidose podem variar na distribuição de amiloide (localizada ou sistémica) e na sua origem (adquirida ou hereditária), de acordo com a proteína precursora de amiloide. Cada proteína precursora de amiloide pode estar associada com ambas as formas de distribuição e origem, dificultando o diagnóstico diferencial. Até ao momento, são conhecidas 36 proteínas constituintes das fibras de amiloide cuja identificação é necessária para um correto diagnóstico e tratamento. Porém, este número elevado de proteínas associadas e a apresentação heterogénea da doença resultam frequentemente num diagnóstico e tratamento incorretos, podendo colocar em risco a vida do paciente. A evolução do diagnóstico da amiloidose nos últimos anos tem vindo a permitir a deteção e tratamento cada vez mais precoce desta doença, aumentando a sobrevivência do paciente. Esta evolução ocorreu devido à introdução de novas técnicas no diagnóstico, como a espectrometria de massa, que identifica a proteína precursora presente através de uma amostra de tecido obtido por biópsia, bem como a técnica de NGS (next generation sequencing) que deteta variantes presentes em amostras de ADN extraídas de sangue, particularmente importante no aconselhamento genético de famílias afetadas por amiloidoses hereditárias. Nesta dissertação foi implementada uma nova abordagem para o diagnóstico da amiloidose no CGMJM, através da técnica de NGS, recorrendo ao desenho de um painel que inclui genes previamente associados à amiloidose. Com esta abordagem, pretende-se melhorar a eficiência e diminuir os custos associados ao diagnóstico desta doença, uma vez que, atualmente, o CGMJM utiliza no seu protocolo de diagnóstico a análise gene a gene através de sequenciação convencional pelo método de Sanger, um procedimento mais dispendioso em termos de tempo e recursos. O painel NGS multigene foi inicialmente testado por ensaios duplamente cegos, utilizando amostras controlo de pacientes com diagnóstico molecular prévio (controlos positivos), tendose revelado eficaz na deteção das variantes causadoras de doença previamente identificadas. A correta deteção das variantes em conjunto com a boa cobertura obtida, permitiu a validação do painel NGS multigene. Posteriormente, o painel foi aplicado em amostras de pacientes com suspeita de amiloidose ainda não-caracterizados molecularmente, numa tentativa de identificar a causa genética associada. Para além da aplicação do painel NGS multigene, este estudo foi complementado por sequenciação convencional com o desenho de primers para análise de outros genes associados à amiloidose, não incluídos no painel previamente desenvolvido, assim como primers para cobrir as regiões com baixa cobertura do painel. A aplicação desta nova abordagem de estudo não permitiu detetar variantes reportadas como patogénicas. No entanto, a eficácia do painel NGS na deteção de variantes foi confirmada. Com este trabalho, o painel NGS multigene foi implementado e ficou demonstrada a sua utilidade como uma boa ferramenta no diagnóstico da amiloidose, garantindo a sequenciação paralela de múltiplas amostras com múltiplos genes alvo, reduzindo o tempo e o custo do diagnóstico e melhorando a sua eficácia clínica.
Descrição
Master’s Degree Dissertation in Biotechnology for Health Sciences
Palavras-chave
Amyloidosis , NGS
Citação