Otimização e validação de um método de análise de etanol em amostras biológicas por SPME-GC

Data
2018-02-23
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Resumo
O consumo de álcool induz problemas de saúde para o indivíduo consumidor e origina prejuízos na sociedade que o rodeia, nomeadamente em acidentes rodoviários. Na tentativa de reduzir o número de ocorrências de acidentes de trânsito, os agentes de autoridade têm feito um controlo mais acentuado nas vias públicas como as operações stop para detetar casos onde o condutor possa estar sob influência de álcool. Estas deteções têm por base o teste do alcoolímetro ou teste do balão. Ao realizar o teste, se o resultado for elevado para o uso de etanol (igual ou superior a 0,5 g/L), o condutor pode ser encaminhado para uma unidade de saúde, onde será realizada a recolha de sangue, com o objetivo de confirmar a presença de etanol ou de outras drogas caso necessário. Geralmente, as análises toxicológicas realizadas para a deteção e quantificação de etanol, baseiam-se no sangue como matriz convencional. No entanto, pode haver um longo tempo entre a abordagem do condutor e a realização da coleta de sangue, fazendo com que a concentração de etanol no organismo do condutor se altere, além disso, a coleta de sangue é um método invasivo e é necessária a presença de um profissional especializado para que seja realizada. Portanto, é necessário o uso de matrizes biológicas alternativas que possam fornecer informações tão relevantes como o sangue. Assim, o presente estudo propõe a utilização da saliva e da urina como matrizes biológicas alternativas para a quantificação de etanol em condutores, uma vez que ambas as matrizes permitem a quantificação de etanol e de outras drogas. Além disso, a coleta destas amostras não é invasiva, podendo ser realizada no local da abordagem e sob supervisão, sem necessitar de um profissional especializado. O presente trabalho experimental englobou duas partes. Na primeira procedeu-se à otimização e validação de um método analítico de cromatografia gasosa acoplada a detetor de ionização de chama (GC-FID) para a deteção e quantificação de etanol em três matrizes biológicas – sangue, saliva e urina. A metodologia descrita neste trabalho consiste no uso da microextração em fase sólida (SPME) para a análise de etanol nas diferentes matrizes biológicas. Inicialmente foi selecionado o tipo de revestimento da fibra SPME simultaneamente com o sal inorgânico a usar no efeito de salting-out. Segundo os resultados obtidos, todas as análises foram realizadas com o auxílio de uma fibra PDMS/DVB juntamente com NaCl e K2CO3. As condições otimizadas de extração de 25ºC, 30 segundos e massa do sal devidamente saturada foram definidas recorrendo a ferramentas de resposta de superfície com a aplicação inicial de um desenho experimental de fatorial completo e posteriormente de um desenho experimental Box-Behnken. O método analítico foi validado, para as três matrizes biológicas, segundo a Norma NP EN ISO/IEC 17025:2005 de modo a validar todos os parâmetros necessários para a sua aplicação como a sensibilidade, a linearidade, a seletividade, os limiares analíticos, a precisão e a exatidão. Na segunda parte, aplicou-se a metodologia a 10 voluntários (5 mulheres e 5 homens) saudáveis que ingeriram determinadas quantidades de cerveja SuperBock® de forma controlada num curto período de tempo (20 min) a fim de verificar a variação do etanol ao longo do tempo nas três matrizes, recolhendo-se devidamente as amostras nos tempos 0, 30, 60 e 90 minutos após a ingestão total da bebida alcoólica. O método provou ser seletivo e linear para as diferentes matrizes numa faixa de concentrações de 0,05-1,0 g L-1 , apresentando a reta y = 0,1471x-0,0002 e o coeficiente de correlação R 2 = 0,9999 para o sangue, y = 0,1217x-0,0171 e R 2 = 0,9980 para a saliva e y = 0,0792x+0,004 e R 2 = 0,9995 para a urina. Os limites de deteção (LD) variaram entre 0,00197 e 0,0444 e os limites de quantificação (LQ) variaram entre 0,00658 e 0,148. O método também apresentou baixos níveis de coeficiente de variação para a repetibilidade e para a precisão intermédia e taxas de recuperação próximas de 100% o que mostra ser um método preciso e exato. Este método foi aplicado em amostras biológicas humanas pelo método do padrão interno, n-propanol, e segundo os resultados obtidos verificou-se que os homens apresentaram maior nível de concentração média de 0,493 g/L no sangue ao tempo de 30 minutos, de 1,137 g/L ao tempo 0 na saliva e de 0,601 g/L na urina após 60 minutos. Para as mulheres os resultados obtidos foram de 0,540 g/L de concentração média de etanol ao tempo de 30 minutos no sangue, 0,584 g/L na saliva ao tempo 0 e 0,728 g/L na urina ao fim de 30 minutos. Em todas as matrizes biológicas analisadas, o teor de etanol esteve abaixo do limite de deteção do método
The consumption of alcohol induces health problems for the individual consumer and causes damages in the society that surrounds him, namely in road accidents. In an attempt to reduce the number of traffic accidents, law enforcement officials have made more stringent controls on public roads such as stop operations to detect cases where the driver may be under the influence of alcohol. These detections are based on the alcohol meter test or balloon test. When carrying out the test, if the result is high for the use of ethanol (equal to or greater than 0,5 g/L), the driver can be referred to a health facility, where blood collection will be performed, with the objective to confirm the presence of ethanol or other drugs if necessary. Generally, toxicological analyzes performed for the detection and quantification of ethanol, are based on blood as a standard matrix. However, there may be a long time between the approach of the driver and the collection of blood, causing the concentration of ethanol in the driver's body to change, in addition, blood collection is an invasive method and it is necessary to presence of a specialized professional to be performed. Therefore, it is necessary to use alternative biological matrices that can provide information as relevant as blood. Thus, the present study proposes the use of saliva and urine as alternative biological matrices for the quantification of ethanol in conductors, since both matrices allow the quantification of ethanol and other drugs. In addition, the collection of these samples is noninvasive and can be performed at the approach site and under supervision, without the need of a specialized professional. The present experimental work comprised two parts. In the first one was to optimize and validate an analytical method of gas chromatography coupled to a flame ionization detector (GC-FID) was developed for the detection and quantification of ethanol in three biological matrices - blood, saliva and urine. The methodology described in this work consists of the use of solid phase microextraction (SPME) for ethanol analysis in different biological matrices. Initially the type of SPME fiber coating was selected simultaneously with the inorganic salt to be used in the salting-out effect. According to the results obtained, all analyzes were performed with the aid of a PDMS/DVB fiber together with NaCl and K2CO3. The optimized conditions of extraction of 25ºC, 30 seconds and mass of the duly saturated salt were defined using surface response tools with the initial application of an experimental design of complete factorial and later of a Box-Behnken experimental design. The analytical method was validated for the three biological matrices according to the standard NP EN ISO/IEC 17025:2005 in order to validate all parameters necessary for its application such as sensitivity, linearity, selectivity, analytical thresholds, accuracy and accuracy. In the second part, the methodology was applied to 10 healthy volunteers (5 women and 5 men) who ingested certain quantities of SuperBock® beer in a controlled manner in a short period of time (20 min) in order to verify the ethanol variation over of the time in the three matrices, and samples were collected at 0, 30, 60 and 90 minutes after total ingestion of the alcoholic beverage. The method proved to be selective and linear for the different matrices in a concentration range of 0,05-1.0 g L-1 , with the line y = 0,1471 x -0,0002 and the correlation coefficient R 2 = 0,99999 for blood, y = 0,11217 x -0,0171 and R 2 = 0,9980 for saliva and y = 0,0792 x + 0,004 and R 2 = 0,9995 for urine. The limits of detection (LD) varied between 0,00197 and 0,0444 the limits of quantification (LQ) varied between 0,00658 and 0,148. The method also showed low levels of coefficient of variation for repeatability and for intermediate accuracy and near recovery rates of 100% which shows to be a precise and exact method. This method was applied in human biological samples by the internal standard method, n-propanol, and according to the results, it was verified that the men had a higher average concentration level of 0,493 g/L in the blood at the time of 30 minutes, of 1,137 g/L at time 0 in saliva and 0,601 g/L in urine after 60 minutes. For women, the results obtained were 0,540 g/L of ethanol concentration at 30 minutes in blood, 0,584 g/L in saliva at time 0 and 0,728 g/L in the urine after 30 minutes. In all biological matrices analyzed, the ethanol content was below the detection limit of the method
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Palavras-chave
SPME , Etanol , GC-FID
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