Extracção e identificação de proteínas possivelmente associadas à ocorrência de abortos espontâneos

Data
2016-01-26
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Resumo
Estudos indicam que cerca de 20% das gravidezes clínicas terminam em aborto espontâneo, principalmente durante o 1º semestre. Apesar de aproximadamente 55% dos mesmos se deverem a anomalias cromossómicas, torna-se essencial complementar as técnicas convencionais de prog- e diagnóstico. A análise proteómica pode desempenhar um papel crucial na abordagem desta problemática. A identificação de proteínas adversas (incluindo proteínas com modificações pós-traducionais) ao desenvolvimento embrionário em humanos pode elucidar as causas desta anomalia. Assim, este trabalho dividiu-se em três fases. A primeira que consistiu na optimização da extracção das proteínas presentes nos abortos, aliado à técnica de electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDSPAGE, sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis). A segunda fase consistiu na separação das mesmas por peso molecular e ponto isoeléctrico, através do procedimento de focalização isoeléctrica, seguido de electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE x IEF, sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis x isoelectric focusing) e, finalmente, procedeu-se à sua identificação por ionização e dessorção a laser assistida por matriz, com recurso ao tempo de voo (MALDI-TOF/TOF, Matrix-assisted laser desorption/ionization – Time of flight/ Mass Spectometry). Com base na técnica de MALDI-TOF/MS foi possível identificar 23 proteínas relacionadas com diversos processos destacando-se a glicólise, regulação do ciclo celular, mecanismos de tradução e angiogénese e resposta a stress. Através da identificação de proteínas como a HSP 70 e 90 e algumas variantes é possível, por exemplo, formular a hipótese de uma infecção bacteriana não detectada. As anti-HSPs produzidas podem ter afectado o crescimento do feto, dado que as mesmas são crucias no desenvolvimento inicial do embrião. Graças a este trabalho, a análise proteica revelou-se uma ferramenta de prog- e diagnóstico promissora nesta problemática, carecendo mais estudos, para que num futuro próximo a mesma se consiga conjugar com as actuais técnicas utilizadas.
Studies show that about 20% of the clinical pregnancies end with the loss of the fetus, resulting in a spontaneous abortion, mainly in the 1st semester. Although around 55% of the spontaneous abortions are due to chromosomes anomalies, it is crucial to add new techniques to the conventional ones, to increase the prog- and diagnosis. The proteomic analysis may play an important role in this kind of studies. The identification of adverse proteins (including proteins with post transcriptional modifications) to the human embryonic development may elucidate the causes related to this anomaly. Taking that in consideration, this work is divided in three distinct phases. The 1st one was the optimization of the protein extraction from the abortions, using the SDSPAGE (sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis) technique. The 2nd phase consisted in the separation of the proteins by their isoelectric point and molecular weight by isoelectric focusing the proteins and using the SDS-PAGE (SDS-PAGE x IEF, sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis x isoelectric focusing) technique, respectively. Finally, the extracted spots were identified by the technique MALDI-TOF/MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization – Time of flight/ Mass Spectrometry). By the analysis made by the MALDI-TOF/MS, it was possible to identify 23 different proteins related with glycolysis, regulation of cellular cycle, transcription and angiogenic mechanisms and stress response. It was possible to identify HSP 70 and 90 and it may be possible to formulate the hypothesis of an undetected bacterial infection. The anti-HSPs produced may have affected the fetus growth due to the fact that these proteins are essential in a healthy embryonic development. Due to this work, the protemic analysis was shown to be a promising prog and diagnosis tool in this kind of issue, only lacking more studies to in a near future, the proteomic analysis becomes a routine technique used to help in this problematic.
Descrição
Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
Palavras-chave
Proteómica , Aborto espontâneo , Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) , Espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF/MS)
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