Caracterização de microrganismos do vinho produtores de fenóis voláteis e pesquisa de bio-estratégias para o seu controlo

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Durante séculos, o vinho tem apresentado grande importância na dieta alimentar do ser humano, na economia e na cultura de várias nações, sobretudo no sul da Europa. Portugal é um dos principais produtores mundiais de vinho e, de acordo com o Instituto da Vinha e do Vinho, tem uma área de viticultura de cerca de 189.640 ha, subdividida em 14 regiões vitivinícolas. O crescimento de microrganismos contaminantes, presentes naturalmente na microbiota da uva, do mosto e do vinho é a maior preocupação na indústria vinícola, resultando em significativas perdas financeiras. Leveduras dos géneros Brettanomyces/Dekkera, Candida, Hansenula, Kloeckera/Hanseniaspora, Pichia, Saccharomycodes e Zygosaccharomyces e bactérias do ácido lático (BAL) e bactérias acéticas são alguns dos microrganismos contaminantes associados à produção de compostos fenólicos influenciando o sabor, o aroma, a cor e a adstringência dos vinhos. Como as bactérias são extremamente sensíveis ao SO2, a utilização de sulfitos é uma forma eficaz de evitar a fermentação malolática, quando esta não é desejada. É também amplamente utilizado para prevenir contaminações microbianas como o crescimento de bactérias do ácido acético ou a proliferação descontrolada de BAL. Uma vez que tem o potencial de prejudicar não só as propriedades organoléticas do vinho, mas também a saúde humana, a utilização de SO2 é regulamentada, quer pela Organização Internacional da Vinha e do Vinho que fixou um máximo de adição de 150-400 mg/L, quer pela União Europeia que restringe a sua utilização a 150 mg/L em vinhos tintos e 200 mg/L em vinhos brancos. Com o objetivo de encontrar bio-estratégias para o controlo de microrganismos indesejáveis no vinho, foram caracterizadas estirpes de BAL e de Brettanomyces/Dekkera isoladas de amostras de vinho com defeito e avaliada a presença/ausência de genes que codificam para as enzimas responsáveis pela produção de fenóis voláteis. Foi ainda pesquisada a atividade antimicrobiana de outros microrganismos (leveduras e bactérias) provenientes de várias matrizes alimentares. Foram obtidos 87 isolados dos quais 58 bactérias e 29 leveduras. As bactérias obtidas foram caracterizadas fenotipicamente (coloração diferencial de Gram, teste do peroxido de hidrogénio e pesquisa da enzima catalase), e todos os microrganismos obtidos foram identificados genotipicamente (sequenciação parcial do rDNA). Relativamente à identificação de isolados bacterianos foram identificadas 8 estirpes de BAL (Pediococcus parvulus, Lentilactobacillus hilgardii e Sporolactobacillus inulinus), sendo as restantes 50 estirpes bacterianas todas pertencentes ao género Bacillus. Das 29 leveduras isoladas, 20 foram identificadas como Brettanomyces bruxellensis e 9 como Saccharomyces cerevisiae. Nos testes de suscetibilidade, as espécies Bacillus subtilis, Bacillus velezensis, Bacillus sp. e Lysinibacillus sphaericus mostraram ser espécies promissoras como agentes de biocontrolo no combate das leveduras do género Brettanomyces. Apesar de se conseguir perceber que houve produção de substâncias inibitórias, em estudos futuros será necessário proceder à sua concentração por métodos mais eficientes e ter também em consideração que a sensibilidade das estirpes de Brettanomyces bruxellensis é variável.
For centuries, wine has been very important in the human diet, economy, and culture of several nations, especially in southern Europe. Portugal is one of the world's leading wine producers and, according to the Instituto da Vinha e do Vinho, has a cultivated area of about 189.640 ha subdivided into 14 wine regions. The development of spoilage microorganisms naturally present in grapes, must and wine is a major concern in the wine industry, resulting in significant financial losses. Yeasts of genera Brettanomyces/Dekkera, Candida, Hansenula, Hanseniaspora/Kloeckera, Pichia, Saccharomycodes and Zygosaccharomyces, lactic acid bacteria (BAL) and acetic acid bacteria are some of the contaminants associated with the production of phenolic compounds in wine, influencing their flavor, smell, color and astringency. Since bacteria are extremely sensitive to SO2, the use of sulfites is an effective way of preventing malolactic fermentation. It is also widely used to prevent microbial contaminations such as the growth of acetic acid bacteria or the uncontrolled proliferation of BAL. Since this chemical compound has the potential to spoil not only the organoleptic properties of wine, but also human health, the use of SO2 is regulated, by the International Organization of Vine and Wine which has set a maximum addition of 150-400 mg/L, and by the European Union, which restricts its use to 150 mg/L in red wines and 200 mg/L in white wines. In order to find bio-strategies to control undesirable microorganisms in wine, BAL and Brettanomyces/Dekkera strains, isolated from defective wine samples, were characterized and the presence/absence of genes coding for enzymes responsible for producing volatile phenols was evaluated. The antimicrobial activity of other microorganisms (yeasts and bacteria) from different food sources was also investigated. A total of 87 isolates were obtained, including 58 bacteria and 29 yeasts. The bacteria isolates were phenotypically characterized (differential Gram stain, hydrogen peroxide test and catalase enzyme research), and all microorganisms were genotypically identified (partial rDNA sequencing). Regarding the identification of bacterial isolates, 8 strains of LAB were identified as Pediococcus parvulus, Lentilactobacillus hilgardii and Sporolactobacillus inulinus, being the remaining 50 bacterial strains all belonging to the Bacillus genus. Of the 29 yeasts isolated, 20 were identified as Brettanomyces bruxellensis and 9 as Saccharomyces cerevisiae. In susceptibility tests, Bacillus subtilis, Bacillus velezensis, Bacillus sp. and Lysinibacillus sphaericus showed to be promising species as biocontrol agents against yeasts belonging to Brettanomyces genus. Although the synthesis of inhibitory compounds could be detected, in future studies it will be necessary to proceed to their concentration by more efficient methods and take into consideration that the sensibility of Brettanomyces bruxellensis strains is variable.
Descrição
Dissertação apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro para obtenção do grau de Mestre em Enologia e Viticultura
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