Fungal bioconversion of Agro-Industrial by-products and modeling of Laccase Kinetics

Projetos de investigação
Unidades organizacionais
Fascículo
Resumo
The study of enzymatic processes involved in fungal bioconversion of lignocellulosic byproducts is the main objective of this thesis. Since cellulose and lignin are the main components of most of these byproducts, the mathematical modeling of bioconversion processes can be used to predict/evaluate the behavior of the interveners in these processes allowing their optimization. In a first phase (Chapter 2), the bioconversion of two byproducts, wheat straw and chestnut shell, was evaluated in its enzymatic component and effect on the hydrolysis of the pretreated substrate, using a commercial mix of holocellulases. Lignocellulolytic enzymes, as fundamental catalysts in bioconversion processes, should be among the study priorities, not only to clarify their mechanisms, but also to search for multiple inhibition relationships. Following this perspective, the lignocellulolytic activity of the fungi and the enzymatic saccharification were evaluated. To clarify the relationships within the general mechanisms of bioconversion/saccharification, the effect of some variables (hydrolysis time, enzymatic activity and holocellulase concentration) was estimated whiles a general predictive model of saccharification. The findings showed that Trametes versicolor was able to significantly increase saccharification in both pretreated substrates. The covariance analysis showed a significant effect between lignin peroxidase and increased straw saccharification. A high consistency was also found, relating the effects of xylanase and laccase activities on the final release of reducing sugars from the chestnut shell. These results can be used for optimization planning in saccharification of this substrate. In a second phase (Chapter 3), the development of the work focused on one of the major enzymes of bioconversion, laccase. Several Michaelis-Menten models (linear and nonlinear) were applied to clarify the inhibition mechanisms that may influence the optimization of the processes. For the mathematical modeling of the inhibition mechanism, the oxidation of a lignin-derived natural substrate, (ferulic acid) in the presence of chlorine, was used. The models were submitted to a ranking methodology, using as estimator, of the relative quality of the different kinetic models, the Akaike Information Criterion (AIC) with respective Akaike Weights. At the end of this chapter it was concluded that, analysis of AIC with Akaike weights allowed the discrimination and quantification of probabilities associated with each model, with only one inhibitor concentration, confirming a competitive inhibition of laccase in the presence of chlorine. Continuing the study of laccase and possible inhibitions (Chapter 4), Bi-Bi substrate models were tested in two features of substrate inhibition: no inhibition and inhibition by reducing and/or oxidizing substrate. During delignification, many intermediates (e.g. 2,6-dimethoxyphenol, DMP) may serve as substrates and inhibitors at the same time. Generally, in the laccase oxidation, the dioxygen is assumed under saturating conditions, simplifying the mechanism and its study. It is also commonly assumed, that the reducing substrate and dioxygen are related via ping-pong mechanism. In order to clarify the laccase mechanism under non-saturating oxygen conditions, two substrates: ABTS (2,2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) and DMP, were used. The discrimination of the models was done based on the ranking methodology previously described (AIC). It was concluded that the most likely models for ABTS and DMP oxidation are Ping-Pong and Theorell-Chance, respectively. The catalytic efficiency of oxygen conversion to water appears to be compatible with a process relatively independent of reducing substrates and the bisubstrate mechanism type. In addition, in the DMP oxidation mechanism laccase is not oxygen-saturated which, in turn, may lead to potential increased reaction rates resulting from the use of oxygen-pressurized bioreactors. The Chapter 5 describes the development of a new methodology and a new integrated equation, which allows the determination of kinetic parameters for two mutually non-exclusive inhibitors, when one of them is produced during the reaction. The determination of kinetic parameters in these circumstances, without the integrated Michaelis-Menten equations, was referred as containing increased errors in parameter estimation. Phosphate and urea, as alkaline phosphatase inhibitors, were used to illustrate the study of this methodology. The results obtained were subjected to a comparative analysis of previously published data to assess: (i) whether the inhibitors were mutually exclusive or non-exclusive inhibitors; ii) if non-exclusive inhibitors, determine the nature of the interaction (facilitation, impediment or independence); iii) determine whether they were non-exclusive unique only to E (enzyme) or ES (enzymesubstrate complex), or both enzyme forms; iv) the type of inhibition and v) the kinetic constants of each inhibitor. The methodology developed, with the new integrated equation, allowed not only to obtain the inhibition constants of each inhibitor, but also to determine the interaction between the two inhibitors. This interaction study is not possible using the Michaelis-Menten initial velocity equations whenever one of the inhibitors is a reaction product.
O estudo dos processos enzimáticos, envolvidos na bioconversão fúngica de subprodutos lenhinocelulósicos, constitui o principal objetivo desta tese. Sendo a celulose e lenhina, os principais componentes, de grande parte desses subprodutos, a modelação matemática dos processos de bioconversão pode ser usada para prever/avaliar o comportamento dos intervenientes nesses processos permitindo a sua otimização. Numa primeira fase (Capítulo 2), a bioconversão de dois subprodutos, palha de trigo e casca de castanha, foi avaliada na sua componente enzimática e efeito na hidrólise do substrato pré tratado, recorrendo a um mix comercial de holocellulases. As enzimas lenhinocelulolíticas, como catalisadores fundamentais nos processos de bioconversão, devem estar entre as prioridades de estudo, não só no sentido da clarificação dos seus mecanismos, mas também pela pesquisa das múltiplas relações de inibição. No seguimento desta perspetiva, avaliou-se a atividade lenhinocelulolítica dos fungos e a sacarificação enzimática. Para clarificar as relações dentro dos mecanismos gerais de bioconversão/sacarificação, o efeito de algumas variáveis (tempo de hidrólise, atividade enzimática e concentração de holocelulases), foi estimado enquanto modelo preditivo geral de sacarificação. Os resultados indicaram que a espécie Trametes versicolor conseguiu aumentar significativamente a sacarificação em ambos substratos pré-tratados. A análise de covariância evidenciou um efeito significativo entre a lenhina peroxidase e o aumento da sacarificação da palha. Foi ainda verificada uma alta consistência, relacionando os efeitos das atividades da xilanase e lacase na liberação final de açúcares redutores da casca da castanha. Esses resultados podem ser utilizados para o planeamento de otimização na sacarificação deste substrato. Numa segunda fase (Capítulo 3), o desenvolvimento do trabalho foi focado numa das principais enzimas da bioconversão, a lacase. Vários modelos (lineares e não lineares) Michaelis-Menten foram aplicados, no sentido de contribuir para a clarificação dos mecanismos de inibição que poderão influenciar a otimização dos processos. Para a modelação matemática do mecanismo de inibição usouse a oxidação de um substrato natural derivado da lenhina (ácido ferúlico), na presença do cloro. Os modelos foram submetidos a uma metodologia de ranking usando como estimador da qualidade relativa dos diferentes modelos cinéticos o Critério de Informação Akaike (AIC) com respetivos Pesos Akaike. Concluiu-se que, a análise de AIC com pesos Akaike permitiu a discriminação e quantificação de probabilidades associadas a cada modelo, com apenas uma concentração de inibidor, confirmando uma inibição competitiva da lacase na presença do cloro. Dando continuidade ao estudo da lacase e possíveis inibições (Capítulo 4), foram testados modelos Bi-Bi substrato em duas vertentes de inibição pelo substrato: sem inibição e inibição pelo substrato redutor e/ou oxidante. Durante a deslehnificação, muitos intermediários (e.g. 2,6-dimetoxifenol, DMP) podem servir como substratos e inibidores ao mesmo tempo. Geralmente, na oxidação da lacase é assumido o oxigénio sob condições saturantes, simplificando o mecanismo e o seu estudo. Também é comum a suposição, de que o substrato redutor e o oxigénio estejam relacionados através de um mecanismo de pingpong. Tendo em vista o esclarecimento do mecanismo da lacase em condições não saturantes de oxigénio foram usados dois substratos ABTS (ácido 2,2'- Azino-bis(3-ethilbenzotiazoline-6-sulfónico) e DMP. A discriminação dos modelos foi baseada na metodologia de “ranking” descrita anteriormente (AIC). Concluiu-se que os modelos mais prováveis para oxidação ABTS e DMP são Ping-Pong e Theorell-Chance, respetivamente. A eficiência catalítica da conversão de oxigénio em água parece ser compatível com um processo relativamente independente da redução de substratos e do tipo de mecanismo de bisubstrato. Além disso, no mecanismo de oxidação do DMP a lacase não está saturada de oxigénio, refletindo um potencial de taxas de reação aumentadas em biorreatores pressurizados por oxigénio. O Capítulo 5 descreve o desenvolvimento de uma nova metodologia e uma nova equação integrada, que permite a determinação dos parâmetros cinéticos para dois inibidores mutuamente não exclusivos, quando um deles é produzido durante a reação. A determinação de parâmetros cinéticos nestes casos, sem as equações integradas de Michaelis-Menten foi referida como contendo erros aumentados na estimativa de parâmetros. O fosfato e ureia, como inibidores da fosfatase alcalina, foram utilizados para ilustrar o estudo desta metodologia. Os resultados obtidos foram submetidos a uma análise comparativa de dados publicados anteriormente, a fim de avaliar: i) se os inibidores são inibidores mutuamente exclusivos ou não exclusivos; ii) se inibidores não exclusivos, determinar a natureza da interação (facilitação, impedimento ou independência); iii) determinar se são não exclusivos apenas na E (enzima) ou ES (complexo enzima-substrato), ou em ambas as formas enzimáticas; iv) o tipo de inibição e v) as constantes cinéticas de cada inibidor. No final deste capítulo concluiu-se que a metodologia desenvolvida com a nova equação integrada, permitiu, não só obter as constantes de inibição de cada inibidor, mas também determinar a interação entre os dois inibidores. O estudo desta interação não é possível obter usando as equações de das velocidades iniciais MichaelisMenten, sempre que um dos inibidores é produto de reação.
Descrição
Thesis submitted to UNIVERSDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO in partial fulfillment of the requirements for the degree of DOCTOR PHILOSOPHY in Biological and Chemistry Sciences
Palavras-chave
Laccase , pretreatment
Citação