Development of models to determine dynamic GNE expression in vivo to aid resolution of sialic acid dysfunction associated with Hereditary Inclusion Body Myopathy

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2010
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Os ácidos siálicos ocorrem maioritariamente como componentes terminais da superfície celular de glicoproteínas e glicolípidos, desempenhando um papel essencial na diversidade biológica dos glicoconjugados e na variedade de funções de sinalização celular (Varki, 1997). Na biossíntese do ácido siálico, a enzima bifuncional UDP-N-acetilglucosamina-2-epimerase/N-acetil Manosamina cinase (GNE) actua de uma forma limitada e catalisa as duas etapas inicias (Keppler et al., 1999), sendo por isso responsável pela regulação pelo processo de sialilação da superfície celular. A enzima é também reconhecida por essencial durante o desenvolvimento embrionário, pois a completa inactivação deste gene em murganho resulta numa precoce letalidade embrionária (Schwarzkopf, et al., 2002). Esta afirmação é confirmada pela ausência de indivíduos homozigóticos com mutações nulas em ambos os alelos do gene GNE (Huizing e Krasnewich, 2009). Contudo, mutações neste gene são a causa de duas doenças na população humana, designadamente sialuria e “hereditary inclusion body myopathy” (HIBM). A sialuria é uma doença dominante autossómica, em que uma única mutação missense no local alostérico do gene GNE é suficiente para causar a perda de inibição por “feedback” da actividade enzimática da epimerase do GNE, resultando na acumulação citoplasmática de ácido siálico livre e excreção de grandes quantidades deste componente na urina (Seppala et al., 1999). Por outro lado, HIBM é doença de carácter autossómico recessivo, iniciando-se habitualmente na idade adulta, e caracterizada por uma fraqueza muscular dos membros superiores e inferiores, com expecção dos músculos quadríceps. Indivíduos com duas mutações no gene GNE (excluindo o sítio alostérico) por norma têm uma actividade enzimática do GNE diminuída a qual, por vezes, pode levar a um decréscimo de sialilação de glicoproteínas e ao aparecimento do fenótipo típico de HIBM (Noguchi et al., 2004, Huizing et al., 2004). Até hoje não foram identificados mecanismos ou vias celulares afectados por mutações neste gene. Na última década, um grande número de estudos têm sido efectuados de forma a investigar a função essencial do GNE, tanto in vivo como in vitro. Na presente tese, diversos estudos são analisados de forma abordar as áreas de investigação deste tema, as quais têm por finalidade a pesquisa de possíveis mecanismos que levam a HIBM, o papel essencial que o GNE desempenha no corpo humano e o tipo de terapias que poderão ser utilizadas futuramente no tratamento de pessoas com doenças relacionadas a deficiências de ácido siálico. O principal objectivo desta tese foi efectuar um trabalho de investigação para avaliar a expressão específica do GNE in vivo, durante a idade embrionária e adulta. Assim, duas abordagens foram essencialmente seguidas em conjunto. A primeira consistiu no desenvolvimento numa linha transgénica de murganhos, onde a expressão do gene de β-galactosidase estaria sobre o controlo do promotor nativo do gene GNE, permitindo assim o acompanhamento da expressão do GNE in vivo, através da coloração de β-galactosidase. A segunda abordagem consistiu na investigação de pontos fulcrais durante o desenvolvimento embrionário, no qual o processo de sialilação poderá ser mais relevante. Para esta última abordagem, foram efectuadas técnicas como a hibridação in situ em embriões “wild-type” de murganhos, nos quais os resultados seriam mais tarde confirmados pela coloração de β-galactosidase nos embriões transgénicos de murganho. Infelizmente, a produção dos animais transgénicos não foi possível de ser realizada até a altura de conclusão desta tese e, portanto, outras técnicas foram seguidas para uma melhor compreensão da função do GNE durante a embriogénese, tais como hibridação por Northern blot e análise de PCR em tempo real. Com base nos estádios de desenvolvimento analisados neste projecto, entre E7.5 e E11.5, encontramos algumas evidências que apoiam a hipótese de que o ácido siálico poderá ser essencial em algumas alturas durante a embriogénese, tal como na idade embrionária E8.0, onde os tecidos placentários poderão actuar como uma fonte vital deste componente, assegurando as necessidades do embrião em desenvolvimento. No dia embrionário E11.5, de forma similar, averiguamos que as necessidades de ácido siálico são muito elevadas e que os transcritos de GNE estão maioritariamente localizados na porção média do embrião, mais propriamente na artéria direita do coração em desenvolvimento.
Sialic acids mainly occur as terminal components of cell surface glycoproteins and glycolipids, playing a major role in the biological diversity of glycoconjugates and in the variety of cellular signaling functions (Varki, 1997). In sialic acid biosynthesis, the bifunctional rate-limiting enzyme UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannosamine kinase (GNE) catalyzes the two initial steps (Keppler et al., 1999) and, therefore, is responsible for the regulation of cell surface sialylation. It is also known to be essential during early embryonic development, since the complete inactivation of the GNE gene by gene targeting leads to early embryonic lethality in mice (Schwarzkopf, et al., 2002). This statement is further supported by the absence of homozygous null mutations in humans (Huizing and Krasnewich, 2009). However, mutations in the GNE enzyme are known to cause two human disorders, sialuria and hereditary inclusion body myopathy (HIBM). Sialuria is an autosomal dominant disorder and one missense mutation in the allosteric site of GNE is sufficient to cause loss of feedback inhibition of epimerase GNE activity, resulting in cytoplasmic accumulation and excretion of large quantities of free sialic acid in the urine (Seppala et al., 1999). On the other hand, HIBM is an autosomal recessive disorder and characterized by adult-onset of muscle weakness in upper and lower limbs, with an interesting sparing of the quadriceps muscles. Patients with two GNE mutations throughout the GNE enzyme (except in the allosteric site), usually have decreased GNE enzyme activity which, in some cases, can lead to decreased sialylation of glycoproteins and to the appearance of HIBM phenotype (Noguchi et al., 2004, Huizing et al., 2004). The mechanisms and cellular pathways affected by GNE mutations and causing the muscle weakness were not identified so far. A number of studies have been pursued over the past decade to investigate the role of GNE both in vitro and in vivo. Herein, these studies are reviewed to analyze where the field has been leading and its current body of knowledge which aims to shed light in particular on the mechanism of the HIBM, the essential role that GNE plays in the human body and the type of therapies that may be able to be utilized in the future to treat patients suffering from sialic acid related disorders. The aim of this thesis was to conduct an investigation to evaluate the exact tissue specific expression of GNE in vivo, during embryogenesis and adulthood. For this, two main approaches were pursued in tandem: one was to develop a transgenic mouse line, where β-galactosidase expression would be under control of the native GNE promoter and thus permitting the tracking of GNE expression in vivo by β-galactosidase staining; and the other one was to search for key points during development where sialylation might be most important. For this last approach, whole-mount in situ hybridization was first conducted on wild-type mouse embryos, in which the results would be later confirmed by β-galactosidase staining of transgenic mouse embryos. Unfortunately, these transgenic mice were not able to be produced by the time of this thesis conclusion and so, other techniques were followed for a better understanding of the role of GNE during embryogenesis, like Northern blot hybridization and real-time PCR analysis. Relying only in the mouse development stages investigated in this thesis, from E7.5 until E11.5, we found some evidence to support the hypothesis that sialic acid might be crucial at certain time points during embryogenesis, such as at age E8.0, where the placental tissues must act like a vital source of sialic acid, reassuring the needs of the developing embryo. At age E11.5, we also found that requirements of sialic acid are very high and that GNE transcripts are mainly localized in middle portion of the embryo’s body, in particular in the right atria of the developing heart.
Descrição
Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
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