Análise do efeito da cetamina no desenvolvimento embrionário de peixe-zebra (Danio rerio) por avaliação da expressão génica

Data
2017
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Resumo
O uso de vertebrados não mamíferos como organismos modelo tem-se revelado útil em diversas áreas de investigação. Destes, o peixe-zebra (Danio rerio) ganhou grande destaque na comunidade científica dado estar bem caracterizado e o seu genoma possuir uma grande homologia com o genoma dos restantes vertebrados. A cetamina, considerada um contaminante emergente e usada como droga de recreação, continua a ser utilizada em medicina humana e veterinária, apesar do seu uso ser bastante controverso. Este trabalho teve como objetivo a análise dos efeitos provocados pela cetamina ao nível da expressão de grupos de genes conservados entre vertebrados, incluindo o homem. Para tal foram feitas exposições curtas (20 minutos) durante as fases de blástula, gástrula e segmentação às concentrações de cetamina 0,2, 0,4 e 0,8 mg/mL e uma exposição longa (24 horas) durante a fase de blástula às concentrações de cetamina 0,05, 0,07 e 0,09 mg/mL. A expressão dos genes de desenvolvimento sonic hedgehog a (shha) e noggin3 (nog3), dos genes de stresse oxidativo glutamato-cisteína ligase, subunidade catalítica (gclc) e glutationa S-transferase pi 1 (gstp1) e dos genes das subunidades dos recetores N-Metil-D-Aspartato grin1 e grin2d foi analisada por PCR em tempo real quantitativo em amostras de RNA isoladas a partir de pools de embriões/larvas de peixe-zebra com 4, 8, 24, 72 e 144 horas. Após exposição a cetamina, o gene shha mostrou uma sobre-expressão generalizada, podendo esta alteração estar a comprometer o estabelecimento normal do padrão de desenvolvimento embrionário. O nog3 apresentou também uma sobre-expressão generalizada, associada a uma diminuição de expressão acentuada às 72 horas pós-fertilização; tais resultados parecem revelar uma tentativa de resgate do normal desenvolvimento esquelético do embrião. Os genes gclc e gstp1 pelo contrário apresentaram uma sub-expressão generalizada que poderá ser resultado da disrupção do sistema de defesa antioxidante ou, contrariamente, da estimulação excessiva deste. As variações na expressão dos genes das subunidades dos recetores NMDA grin1 e grin2d foram específicos da fase de desenvolvimento durante a qual ocorreu a exposição, tendo-se observado diminuições e aumentos de expressão génica. A análise destes três grupos de genes permitiu observar que a cetamina provoca variações de expressão estatisticamente significativas, podendo estar a comprometer o normal desenvolvimento embrionário do peixe-zebra, revelando desta forma o seu potencial tóxico e teratogénico.
The use of non-mammalian vertebrates as model organisms have been useful in many investigation areas and zebrafish (Danio rerio) have gained high emphasis in the scientific community since it is well characterized and it shares high homology to other vertebrate genomes. Ketamine, considered an emergent contaminant and used as a recreational drug, continues to be widely used on human and veterinary medicine, even though its use is quite controversial. This work had the goal to analyze the effects caused by ketamine at the expression level of gene groups conserved between vertebrates, including man. For this were made short exposures (20 minutes) during blastula, gastrula and segmentation phases to ketamine doses of 0.2, 0.4 and 0.8 mg/mL and a long exposure (24 hours) during the blastula phase to ketamine doses of 0.05, 0.07 and 0.09 mg/mL. The expression of embryonic development genes sonic hedgehog a (shha) and noggin3 (nog3), oxidative stress genes glutamate-cysteine ligase, catalytic subunit (gclc) and glutathione S-transferase pi 1 (gstp1) and N-methyl-D-aspartate receptor subunit genes grin1 and grin2d was analyzed by real time quantitative PCR on RNA samples isolated from 4, 8, 24, 72 and 144 hours post-fertilization embryos/larvae pools. After exposure the shha gene was overexpressed and this variation may be compromising the normal patterning of the embryo. nog3 also suffered an overall overexpression plus a severe decrease of expression at 72 hours post-fertilization; this results seem to reveal an attempt to rescue the normal skeleton development of the embryo. Contrariwise, the gclc and gstp1 genes were underexpressed and this might either be the result of a disruption on the antioxidant defenses or a strong activation of this system. The effects observed on the NMDA receptor subunit genes grin1 and grin2d were specific to the exposure phase and consisted on either under and overexpression. The analysis of this three gene groups has revealed that ketamine causes statistically significant gene expression variation and might be compromising the normal zebrafish embryonic development, reveling this way its toxic and teratogenic potential.
Descrição
Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
Palavras-chave
Peixe-Zebra (Danio rerio) , Cetamina , Desenvolvimento embrionário , Stresse oxidativo , Expressão génica
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