Molecular basis of Saccharomyces cerevisiae adaptation to nitrogen-limiting fermentation conditions: impact on yeast growth and hydrogen sulfide formation

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2016
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Resumo
Durante a fermentação alcoólica, as leveduras enfrentam uma diversidade de stresses ambientais, nomeadamente, elevadas concentrações de açúcar, baixo pH, aumento da concentração de etanol e limitação de nutrientes, em particular, a limitação de azoto assimilável. A limitação na concentração de azoto assimilável presente no mosto é uma das principais causas de fermentações problemáticas encontradas na indústria vínica contemporânea, entre elas, fermentações amuadas ou lentas. Em condições vínicas, baixos níveis iniciais de azoto afetam o crescimento das leveduras e produção de biomassa, resultando numa taxa de fermentação reduzida. Por essa razão, para o desenvolvimento de leveduras vínicas melhoradas, os alvos principais estão sobretudo relacionados com o desempenho fermentativo e a qualidade do produto final. Neste trabalho, a utilização de uma coleção de leveduras prototróficas permitiu a identificação de genes envolvidos em aspetos nutricionais da fermentação, através da avaliação do crescimento de mutantes como um preditor da atividade fermentativa, em mosto sintético com limitação de azoto (GJM67). A inclusão de um meio adicional de controlo, GJM267, no qual a concentração de azoto não é um fator limitante ao crescimento ou à atividade fermentativa, permitiu a identificação de 973 genes envolvidos na resposta à adaptação a condições de fermentação vínica (WAR - Wine Adaptation Response genes) e de 1303 genes associados ao crescimento celular das leveduras em fermentações com limitação de azoto (NLF - Nitrogen Limited Fermentation genes). A identificação destes genes não só será útil no desenvolvimento de estirpes vínicas com atividade fermentativa melhorada e vigorosa, como também será um ponto de partida para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao processo de fermentação do vinho, particularmente sob condições de stresse de azoto. Adicionalmente, e considerando o papel fundamental do azoto na formação de compostos voláteis que contribuem para a qualidade final do vinho, este estudo também visou a identificação de genes-alvo que participam na formação de sulfureto de hidrogénio, propondo possíveis mecanismos celulares subjacentes à sua formação. Em suma, os resultados apresentados neste trabalho fornecem informações importantes para uma compreensão mais aprofundada dos mecanismos moleculares subjacentes ao crescimento de leveduras S. cerevisiae durante a vinificação. Além disso, os genes alvo específicos aqui identificados poderão ser utilizados em processos de seleção de culturas starter e/ou no melhoramento de estirpes com o objectivo final de fornecer à indústria vínica ferramentas que lhes permita um maior controlo do processo, para a produção de vinhos de elevada qualidade.
During alcoholic fermentation yeasts have to cope with a temporal exposure to a diversity of environmental stresses namely high concentrations of sugar, low pH, increasing concentration of ethanol and nutrient limitation, in particular, assimilable nitrogen. Yeast assimilable nitrogen is often limiting in grape juice being one of the main reasons for fermentation inefficiencies encountered in contemporary winemaking, especially those related to slow and incomplete fermentations. Under wine-making conditions, initial low levels of nitrogen act by limiting growth and biomass, resulting in a reduced fermentation rate. For that reason, for the development of improved wine yeasts, the principal targets are mainly linked to fermentation performance and final product quality. In this study, with the availability of a yeast prototrophic deletion collection, we were able to identify genes involved in nutrition-linked fermentation attributes by evaluating yeast mutants growth, as a predictor of fermentative activity, on a nitrogen-limited synthetic grape juice medium (GJM67). The inclusion in our experiment design of an additional control condition, GJM267, where nitrogen was not a growth and fermentation limiting factor, allowed the identification of 973 genes involved in wine fermentation adaptation response (WAR - Wine Adaptation Response genes) and 1303genes associated with yeast cells growth under nitrogen limited fermentations (NLF - Nitrogen Limited Fermentation genes). The identification of such genes will not only be useful in the development of improved and vigorous fermentative strains, but also will figure the starting point of a better understanding of the molecular mechanisms behind the wine fermentation process, particularly under nitrogen-stress conditions. In addition, and considering the major role of nitrogen status in the formation of volatile compounds that contribute to final quality of wine, this study also aspired to unveil target genes involved in the formation of hydrogen sulfide, proposing possible subjacent cellular mechanisms behind its formation. In sum, this integrative study clearly provide important information towards the deeper understanding of the mechanism by which S. cerevisiae copes with nitrogen limitation during winemaking and contributes with new findings on the relationships between nitrogen availability, yeast cell growth and hydrogen sulfide production. Moreover, the specific target genes herein identified could be included in a yeast selection program and may be useful to the industry in designing better strategies to improve wine quality.
Descrição
Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
Palavras-chave
Fermentação alcoólica , Azoto , Levedura de vinho , Saccharomyces cerevisiae , Ácido sulfídrico , Análise genómica funcional
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