Avaliação de biomarcadores histológicos e moleculares relacionados com apoptose em peixe-sebra (danio rerio) após exposição aguda a cobre

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2008
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Resumo
O cobre é um elemento essencial que ocorre em condições naturais em águas não poluídas, tendo sido verificada a contaminação dos ecossistemas aquáticos resultante da actividade mineira, da agricultura, da indústria, bem como de efluentes domésticos. Em consequência, existe um grande interesse na determinação de biomarcadores de exposição ao cobre em peixes de água doce, quer para a monitorização dos ecossistemas aquáticos, quer como instrumento de análise da sua toxicidade. Com o objectivo de avaliar o impacto dos poluentes na qualidade ambiental tem sido considerado pertinente desenvolver estudos acerca dos seus efeitos negativos nos ecossistemas. Neste contexto, o uso de marcadores biológicos ou biomarcadores tem assumido particular importância aos níveis molecular e celular, atendendo a que é um instrumento sensível de detecção rápida dos efeitos biológicos de avaliação da qualidade dos ecossistemas. No presente trabalho foram utilizadas técnicas de biologia molecular, histologia e imunohistoquímica, tendo como objectivo determinar efeitos da exposição ao cobre, na indução de apoptose pela via extrínseca (via caspases), na brânquia de peixe-zebra (Danio rerio). Na biologia molecular foi analisada a expressão dos genes das caspase-8 e caspase-3 por PCR em tempo real (RT-PCR). A expressão do gene da capase-8 na brânquia não foi detectada e no caso do gene da caspase-3 os primers utilizados não foram adequados, uma vez que ocorreu a formação de dímeros. A avaliação histopatológica permitiu determinar que o tempo de exposição ao cobre não teve qualquer influência no aparecimento de lesões, enquanto a concentração, pelo contrário evidenciou diferenças significativas. Na concentração mais baixa, verificou-se a presença de edema e vasodilatação, enquanto que na concentração mais elevada se observou: fusão lamelar, diminuição da espessura do epitélio filamentar e necrose/ruptura da região superior do epitélio filamentar. A avaliação, por imunohistoquímica, da presença de caspase-3 activa na brânquia mostrou não existirem diferenças significativas, na marcação de células em apoptose, entre os peixes provenientes do grupo controlo e os peixes expostos a duas concentrações de cobre diferentes. Este trabalho prova a importância do desenho e da utilização de primers específicos para cada espécie e a necessidade de combinar a avaliação da expressão de genes com a presença da proteína por eles codificada, na determinação de efeitos de contaminantes nos organismos.
Copper is an essential micronutrient naturally present in unpolluted freshwaters, but contamination of aquatic systems, occurring as a result of mining, agricultural and manufacturing activities, and also due to municipal effluents is frequently observed. As a consequence, there is considerable interest in determining a reliable biomarker for copper exposure in freshwater fish, for both monitoring aquatic systems and as an analytical tool for copper toxicity. In order to assess the impact of pollutants on environmental quality it has become pertinent to carry out a rapid assessment of their deleterious effects on ecosystem. In this context, the use of biological markers or biomarkers measured at molecular and cellular level is of great importance as sensitive early warming tools for biological effect measurement in environmental quality assessment. In the present work molecular biology, histology and imunnohistochemistry were used aiming copper exposure effects evaluation in apoptosis extrinsic pathway induction (via caspases), in zebrafish (Danio rerio) gills. Caspase-8 and caspase-3 gene expression were determined by real-time PCR (RT-PCR). Caspase-8 expression in gill was not detected, while for caspase-3 the primers used were not efficient, since primer-dimers formation occurred. The histopathological analysis allowed to determine that the time (24 h and 48 h) of copper exposure had no influence on lesions occurrence, although the concentration (12,5 and 100 µg/L) induced significant differences. In the lower concentration, edema and vasodilatation was observed, while in the higher concentration lamellar fusion, decreased filament epithelium layers and necroses/filament upper region rupture was seen. The presence of active caspase-3 in gill, evaluated by immunohistochemistry, showed no evident differences in apoptotic cells signal, between fish exposed and non-exposed to copper. This work shows the importance of specific primer design and use for each species and the need to combine gene expression and protein presence studies in the evaluation of contaminants effects.
Descrição
Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
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