Lactococcus lactis RBT18 isolated from rainbow trout: antimicrobial activity, taxonomic identification, bacteriocin purification and mass spectrometry analyses
Data
2021-03-17
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Resumo
As aquaculture is recognized as the fastest-growing food-producing sector worldwide, new obstacles and challenges emerge derived from its intensification. In this respect, infectious diseases, such as lactococcosis caused by Lactococcus garvieae, are portrayed as one of those barriers and as a critical limiting factor in modern aquaculture. The antimicrobial properties of Lactic Acid Bacteria (LAB), mainly the production of organic acids and bacteriocins (e.g., the lanthionine containing nisins A and Z; NisA and NisZ, respectively), led to propose LAB as probiotics to be used as an alternative and/or complementary strategy to vaccination and conventional chemotherapy, in aquaculture. L. lactis RBT18, isolated from cultured rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum), exerts a strong direct and extracellular antimicrobial activity against L. garvieae and other ichthyopathogens, being this antimicrobial activity heat-resistant (100ÂșC, 10 min), and thus suggesting the involvement of a thermostable antimicrobial compound (i.e., bacteriocin). Cross-immunity tests using the agar-well-diffusion test (ADT) and PCR assays suggested that NisA/Z is the bacteriocin responsible for the extracellular antimicrobial activity exerted by L. lactis RBT18. To demonstrate this hypothesis, the bacteriocin was purified to homogeneity by two different multi-chromatographic procedures. MALDI-TOF/TOF MS analyses of purified samples after the last reversephase chromatography step identified, in both procedures, the presence of NisZ (3,330 Da), and its oxidized form (3,346 Da), derived from the oxidation of a lanthionine ring. Noteworthy, the oxidized form of NisZ showed a diminished antimicrobial activity, which could increase the chances of bacterial pathogens to evade its antimicrobial activity. Hence, the experimental approach carried out in this work constitutes an appropriate strategy for the preliminary identification of nisin-producing lactococcal strains and, in particular, both multi-chromatographic purification procedures were found to be suitable for the purification of NisZ, in both native and oxidized forms, with the purification procedure I being the most efficient and appropriate for this purpose, since the antimicrobial activity yield and the increase in specific antimicrobial activity were respectively 18 and 21-times higher than using the purification procedure II. Further experiments are necessary to assess the in vitro and in vivo safety and efficiency of L. lactis RBT18 as probiotic in aquaculture but also to gain insight into the nisin oxidation process, and its implications on both bacteriocin pharmacokinetics and pharmacodynamics, to optimize the environmental conditions leading to reduce bacteriocin oxidation and thus bacterial pathogen resistance.
Com o reconhecimento da aquacultura como o sector de produção alimentar que mundialmente regista o maior crescimento, novos obstĂĄculos e desafios, derivados da sua inevitĂĄvel intensificação, emergem. A esse respeito, as doenças infecciosas, como a lactococose causada por Lactococcus garvieae, nĂŁo sĂł sĂŁo retratadas como um desses obstĂĄculos, como tambĂ©m sĂŁo um factor limitante crĂtico na aquacultura moderna. As propriedades antimicrobianas apresentadas pelas BactĂ©rias Ăcido LĂĄcticas (LAB), nomeadamente a produção de ĂĄcidos orgĂąnicos e bacteriocinas (e.g. detentoras de lantionina como as nisina A e Z; NisA e NisZ respectivamente), levaram a que as LAB, em aquacultura, fossem propostas como probiĂłticos de uso alternativo, e/ou complementar, Ă s estratĂ©gias de vacinação ou quimioterapia convencionais. L. lactis RBT18, isolada a partir de uma produção de truta arco-Ăris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum), demonstra uma forte actividade antimicrobiana directa e extracelular contra L. garvieae e outros ictiopatĂłgenos, sendo esta resistente ao calor (100ÂșC, 10 min), sugerindo o envolvimento de um composto antimicrobiano termoestĂĄvel (i.e., bacteriocina). Testes de imunidade-cruzada, recorrendo ao agar-well-diffusion test (ADT), e testes PCR, sugeriram que a bacteriocina responsĂĄvel pela actividade antimicrobiana extracelular demonstrada por L. lactis RBT18 seria a NisA/Z. De modo a demonstrar esta teoria, a bacteriocina foi purificada atĂ© Ă homogeneidade recorrendo a dois distintos protocolos multi-cromatogrĂĄficos. ApĂłs as duas cromatografias, anĂĄlises MALDI-TOF/TOF MS das amostras identificaram a presença de NisZ (3,330 Da), bem como da sua forma oxidada (3,346 Da), derivada da oxidação de um anel de lantionina. Notavelmente, a forma oxidada de NisZ apresentou uma actividade antimicrobiana diminuĂda, o que poderĂĄ aumentar as hipĂłteses de evasĂŁo ao efeito antimicrobiano por parte de determinados patĂłgenos. Portanto, nĂŁo sĂł a abordagem desenvolvida ao longo deste trabalho demonstrou ser uma estratĂ©gia adequada para a identificação preliminar de estirpes productoras de nisina pertencentes ao gĂ©nero Lactococcus, como tambĂ©m ambos os protocolos de purificação multi-cromatogrĂĄfica demonstraram ser apropriados para a purificação de NisZ, tanto na sua forma natural como oxidada. No entanto, o protocolo de purificação I demonstrou ser mais eficiente e adequado para o propĂłsito, na medida em que o rendimento de actividade antimicrobiana e o aumento da actividade especĂfica observados, foram respectivamente 18 e 21 vezes superiores aos verificados utilizando o protocolo de purificação II. NĂŁo obstante, futuros estudos serĂŁo necessĂĄrios para avaliar a segurança e eficiĂȘncia, in vitro e in vivo, de L. lactis RBT18 como um potencial probiĂłtico em aquacultura, bem como para obter um maior conhecimento sobre o processo de oxidação da nisina. De igual modo, serĂĄ necessĂĄrio avaliar as implicaçÔes da oxidação da nisina tanto na sua farmacocinĂ©tica, como na sua farmacodinĂąmica, de modo a optimizar as condiçÔes ambientais que conduzem a uma menor oxidação da bacteriocina, portanto, reduzindo as resistĂȘncias por parte de patĂłgenos de origem bacteriana.
Com o reconhecimento da aquacultura como o sector de produção alimentar que mundialmente regista o maior crescimento, novos obstĂĄculos e desafios, derivados da sua inevitĂĄvel intensificação, emergem. A esse respeito, as doenças infecciosas, como a lactococose causada por Lactococcus garvieae, nĂŁo sĂł sĂŁo retratadas como um desses obstĂĄculos, como tambĂ©m sĂŁo um factor limitante crĂtico na aquacultura moderna. As propriedades antimicrobianas apresentadas pelas BactĂ©rias Ăcido LĂĄcticas (LAB), nomeadamente a produção de ĂĄcidos orgĂąnicos e bacteriocinas (e.g. detentoras de lantionina como as nisina A e Z; NisA e NisZ respectivamente), levaram a que as LAB, em aquacultura, fossem propostas como probiĂłticos de uso alternativo, e/ou complementar, Ă s estratĂ©gias de vacinação ou quimioterapia convencionais. L. lactis RBT18, isolada a partir de uma produção de truta arco-Ăris (Oncorhynchus mykiss, Walbaum), demonstra uma forte actividade antimicrobiana directa e extracelular contra L. garvieae e outros ictiopatĂłgenos, sendo esta resistente ao calor (100ÂșC, 10 min), sugerindo o envolvimento de um composto antimicrobiano termoestĂĄvel (i.e., bacteriocina). Testes de imunidade-cruzada, recorrendo ao agar-well-diffusion test (ADT), e testes PCR, sugeriram que a bacteriocina responsĂĄvel pela actividade antimicrobiana extracelular demonstrada por L. lactis RBT18 seria a NisA/Z. De modo a demonstrar esta teoria, a bacteriocina foi purificada atĂ© Ă homogeneidade recorrendo a dois distintos protocolos multi-cromatogrĂĄficos. ApĂłs as duas cromatografias, anĂĄlises MALDI-TOF/TOF MS das amostras identificaram a presença de NisZ (3,330 Da), bem como da sua forma oxidada (3,346 Da), derivada da oxidação de um anel de lantionina. Notavelmente, a forma oxidada de NisZ apresentou uma actividade antimicrobiana diminuĂda, o que poderĂĄ aumentar as hipĂłteses de evasĂŁo ao efeito antimicrobiano por parte de determinados patĂłgenos. Portanto, nĂŁo sĂł a abordagem desenvolvida ao longo deste trabalho demonstrou ser uma estratĂ©gia adequada para a identificação preliminar de estirpes productoras de nisina pertencentes ao gĂ©nero Lactococcus, como tambĂ©m ambos os protocolos de purificação multi-cromatogrĂĄfica demonstraram ser apropriados para a purificação de NisZ, tanto na sua forma natural como oxidada. No entanto, o protocolo de purificação I demonstrou ser mais eficiente e adequado para o propĂłsito, na medida em que o rendimento de actividade antimicrobiana e o aumento da actividade especĂfica observados, foram respectivamente 18 e 21 vezes superiores aos verificados utilizando o protocolo de purificação II. NĂŁo obstante, futuros estudos serĂŁo necessĂĄrios para avaliar a segurança e eficiĂȘncia, in vitro e in vivo, de L. lactis RBT18 como um potencial probiĂłtico em aquacultura, bem como para obter um maior conhecimento sobre o processo de oxidação da nisina. De igual modo, serĂĄ necessĂĄrio avaliar as implicaçÔes da oxidação da nisina tanto na sua farmacocinĂ©tica, como na sua farmacodinĂąmica, de modo a optimizar as condiçÔes ambientais que conduzem a uma menor oxidação da bacteriocina, portanto, reduzindo as resistĂȘncias por parte de patĂłgenos de origem bacteriana.
Descrição
Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinåria
Palavras-chave
aquaculture , probiotics