Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/10586
Title: Validation of hiPSC-NKX2.5-GFP line for cardiac differentiation
Authors: Santos, Fernando Augusto Gonçalves dos
Advisor: Viegas, Carlos Alberto Antunes
Dulak, Józef
Keywords: cardiomyocytes
cardiovascular diseases
Issue Date: 13-Jul-2021
Abstract: The induced pluripotent stem cell (iPSC) technology has created great expectations to advance the development of therapies for cardiovascular diseases, the leading cause of death worldwide. Accordingly, human iPSCs (hiPSCs) efficiently differentiate to cardiomyocytes (hiPSC-CM) which has been already applied in pre-clinical studies, among others, to improve heart regeneration after myocardial infarction. Nevertheless, it is suggested that therapeutic efficiency of hiPSC-CM may be related to the stage of their development. Thus, the main aim of this study was to validate the hiPSC-NKX2.5-GFP line, that enables expression of a cardiacspecific transcription factor, NKX2.5 which is also an established marker of cardiac progenitor cells, and a reporter gene, green fluorescent protein (GFP) from the same promoter, allowing the identification and facilitating the isolation of early cardiomyocytes in the first days of hiPSCs differentiation. Using polymerase chain reaction (PCR) we confirmed the insertion of the GFP-encoding sequence into the locus of the NKX2.5 gene. hiPSCs were subjected to cardiac differentiation. Flow cytometric analysis revealed the presence of cardiac troponin T- and GFP-positive cells among differentiating hiPSCs. The sorted population of GFP-positive cells also confirmed the insertion of the GFP-encoding sequence identified through reverse transcription PCR. The results proved the possibility of the detection of cardiac progenitor cells based on GFP fluorescence dependent on NKX2.5 activation. A quantitative measurement of the differentiation efficiency confirmed that the method used for the genetic construction of tested cell line does not interfere with its cardiac differentiation potential. Therefore, it could be concluded that the hiPSC-NKX2.5-GFP line can be used for identification and isolation of early cardiomyocytes being a valuable tool for studies of therapeutic approaches to treat cardiovascular diseases.
A tecnologia de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) criou grandes expectativas no que diz respeito ao avanço do desenvolvimento de terapias para as doenças cardiovasculares, consideradas como a principal causa de morte em todo o mundo. Assim, as iPSCs humanas (hiPSCs) diferenciam-se de forma eficiente em cardiomiócitos (hiPSC-CM), o que já foi aplicado em estudos pré-clínicos, entre outros, para melhorar a regeneração cardíaca após a ocorrência de um enfarte do miocárdio. No entanto, sugere-se que a eficácia terapêutica dos hiPSC-CM pode estar relacionada com o seu estágio de desenvolvimento. Assim, o objetivo principal deste estudo foi validar a linha hiPSC-NKX2.5-GFP, que permite a expressão de um fator de transcrição específico para o coração, NKX2.5, que também é um marcador estabelecido de células progenitoras cardíacas e um gene repórter, a proteína fluorescente verde (GFP) de um mesmo promotor, permitindo a identificação e facilitando o isolamento de cardiomiócitos precoces nos primeiros dias de diferenciação das hiPSCs. Usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), confirmamos a inserção da sequência codificadora de GFP no locus do gene NKX2.5. As hiPSCs foram submetidas a um protocolo de diferenciação cardíaca. A análise de citometria de fluxo revelou a presença de células positivas para a troponina T e GFP entre hiPSCs em diferenciação. A população classificada de células positivas para GFP também confirmou a inserção da sequência de codificação de GFP, identificada por PCR de transcrição reversa. Os resultados comprovaram a possibilidade de detecção de células progenitoras cardíacas com base na fluorescência GFP. Uma medição quantitativa da eficiência de diferenciação confirmou que o método utilizado para a construção genética da linha celular testada não interfere no seu potencial de diferenciação cardíaca. Portanto, pode-se concluir que a linha hiPSC-NKX2.5-GFP pode ser utilizada para identificação e isolamento de cardiomiócitos precoces, sendo uma ferramenta valiosa para estudos de abordagens terapêuticas no tratamento das doenças cardiovasculares.
Description: Dissertation for the purpose of obtaining a Master's degree in Biotechnology for Health Sciences
URI: http://hdl.handle.net/10348/10586
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:DGB - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

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