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Title: Analysis of the involvement of transposable elements in spinal muscular atrophy
Authors: Cunha, Catarina Filipa Eira Velha
Advisor: Adega, Maria Filomena Lopes
Chaves, Raquel Maria Garcia dos Santos
Keywords: Genomic Instability
Neuromuscular disease
Issue Date: 15-Jul-2021
Abstract: Spinal Muscular Atrophy (SMA) is an autosomal recessive neuromuscular disease caused by deletion and/or mutations in Survival Motor Neuron gene (SMN1). SMN1 is located in a highly unstable region. This instability may come as a result of the activity of transposable elements (TEs). Transposable elements are DNA sequences capable of movement and insertion into new genome locations. This transposition capacity can have many impacts in gene expression and stability. SMN1 sequence is highly enriched in Alu elements and in Long Interspersed Nuclear Elements 1 (LINE-1) that could be a potential source of genomic instability. TEs in general are often associated with disease, among them various neuromuscular conditions. To understand the potential involvement of TEs in major chromosomal alterations and in Spinal Muscular Atrophy onset we characterized a SMA cell line used as a model, performing different cytogenetic and genetic methodologies, and compared the results with a healthy/control counterpart. First, we karyotyped the SMA cell line and then used whole chromosome painting probes to increase the resolution of the analysis. Then, an extensive physical mapping of the Alu and L1 sequences was conducted in metaphasic chromosomes of both cell lines. Since TEs and human satellite DNAs (SatDNAs) are often associated with each other, we also physically mapped SatDNAs in both cell lines chromosomes. Lastly, Alu and L1 expression was analyzed by RNA-Fluorescence in Situ Hybridization (RNA-FISH) and by real time reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT qPCR) to analyze a possible expression dysregulation. Additionally, we evaluated if TEs are epigenetically regulated in both cell lines. SMA cell line karyotype did not show, apparently, structural chromosomal alterations but showed numerical alterations. Using whole chromosome painting probes we found alterations in chromosomes 3 and 6. The physical mapping of Alu and L1 elements showed that SMA cell line exhibit a higher amount of these elements than the normal cell line suggesting an enrichment of TEs in the SMA cell line and a possible role on SMA onset. SatDNAs location analysis showed that SatDNAs I, II, III and alpha are present in less amount in the SMA cells, contrarily to human beta satellite DNA presents higher amount. Additionally, we identified micronuclei and giant nuclei, markers of cellular and genetic instability. RNA-FISH showed that Alu and L1 transcripts occur in higher amount in the SMA cell line when compared to the control cell line. Contrarily, the RT-qPCR assay showed that both Alu and L1 elements are highly expressed in the normal cell line, probably due to the neonatal origin of this cell line. This incongruity indicates that RT-qPCR is the best tool for TEs expression quantification. Furthermore, our results lead us to believe that L1 elements in the SMA cell line are mostly regulated by DNA methylation, contrarily to Alu elements that seem to be regulated by other mechanisms. In conclusion, this SMA cell model is unstable, in line with the SMA phenotype that affects cellular stability. We believe that the TEs enrichment in this SMA cell line could be the related with the instability detected.
A Atrofia Muscular Espinhal (SMA) é uma doença neuromuscular autossómica recessiva causada pela deleção e/ou mutações no gene Survival Motor Neuron 1 (SMN1). A instabilidade associada à região cromossómica do SMN1, pode dever-se à presença de elementos transponíveis (TEs). Os TEs são sequências de DNA com capacidade de transposição, podendo ter um impacto na expressão e na estabilidade génica. A sequência do gene SMN1 é enriquecida em elementos Alu e Long Interspersed Nuclear Elements 1 (L1), que poderão ser uma potencial fonte de instabilidade genómica. Em geral, os TEs estão frequentemente associados a doenças, entre elas doenças neuromusculares. Para compreender o envolvimento destes elementos em rearranjos cromossómicos e o seu potencial papel no aparecimento da SMA, foi caracterizada uma linha celular desta doença utilizando diferentes técnicas. Inicialmente, foi construído o cariótipo da linha celular doente e depois foram usadas sondas de painting para aumentar a resolução da análise. De seguida, foi feito um extenso mapeamento físico das sequências Alu e L1 em cromossomas metafásicos da linha celular de SMA e estes resultados foram comparados com os obtidos numa linha celular controlo. Foram também mapeadas as sequências de DNA satélite humano (SatDNAs) em cromossomas metafásicos. Por fim, a expressão dos elementos Alu e L1 foi analisada por RNA-Fluorescence in Situ Hybridization e por Real Time Reverse Transcriptase quantitative Polymerase Chain Reaction (RT qPCR), com o objetivo de avaliar a sua desregulação na linha celular doente. Por fim, avaliamos se os TEs estão a ser regulados epigeneticamente. O cariótipo da linha celular de SMA não mostra grandes alterações cromossómicos, mas surgiram alterações numéricas. As sondas de painting utilizadas revelaram alterações nos cromossomas 3 e 6. Os nossos resultados de mapeamento físico dos elementos Alu e L1 mostraram que a linha celular de SMA possui uma maior quantidade destes elementos em comparação com a linha celular normal, sugerindo um enriquecimento de TEs na linha celular doente e um possível envolvimento destes elementos na doença. A análise da localização física dos SatDNAs mostrou que as famílias I, II, III e alfa estão presentes em menor quantidade na linha celular doente enquanto o SatDNA da família beta está presente em maior quantidade relativamente à linha celular controlo. Adicionalmente, foram identificados micronúcleos e núcleos gigantes, estruturas frequentemente associadas à instabilidade celular. A análise física da expressão dos elementos Alu e L1 mostrou que a linha celular doente tem maiores níveis de expressão do que a linha normal. Contrariamente, os resultados de RT-qPCR mostraram que os elementos Alu e L1 têm maiores níveis de expressão na linha normal do que na linha celular doente, o que pode ser explicado pelo facto da linha celular controlo ser neonatal. Os nossos resultados levam-nos a crer que os elementos L1 são maioritariamente regulados por metilação enquanto os elementos Alu serão regulados por outros mecanismos. Em conclusão, esta linha celular de SMA é instável, como era esperado uma vez que esta doença está muitas vezes associada à instabilidade celular. O enriquecimento em TEs desta linha poderá estar relacionado com a instabilidade detetada.
Description: Este trabalho foi expressamente elaborado com vista à obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia para as Ciências da Saúde. Esta dissertação cumpre todos os requisitos técnicos e científicos exigidos pela Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.
URI: http://hdl.handle.net/10348/10632
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:DGB - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

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