Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/10669
Title: The effect of stress factors associated with cheese manufacture on Shiga toxin-converting prophage induction
Authors: Vieira, Rui Pedro Oliveira do Amaral
Advisor: Picozzi, Claudia
Lopes, Paula Filomena Martins
Keywords: Cheese
STEC
Issue Date: 26-Feb-2021
Abstract: Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are food-borne pathogens with a low infectious dose implicated with diseases including the haemolytic uremic syndrome (HUS), haemorrhagic colitis (HC) and bloody diarrhoea. The major concern in regard to STEC virulence is the production of Shiga toxins, a diverse group of lambdoid bacteriophage-encoded toxins, which target small blood vessels of organs such as kidneys, causing cell-tissue apoptosis. It is estimated that 3 million cases of illness worldwide are caused by STEC infection per year. Milk and dairy products are the second most impactful source for STEC outbreaks, besides meat. This raises concerns of inadequate food safety policies, provided that the main reservoir of STEC are farm animals such as cattle, sheep and goats, and the major source of infection is faecal contamination of foods or water. In Italy, cheese is a highly consumed dairy product due to high offer and demand, with an important contribution to the country’s economy. Given that a rising trend of STEC outbreaks in Europe (Italy inclusive) has been reported by the European Food Safety Authority, in this dissertation we studied the effect of several stimuli that STEC may encounter during cheese manufacture on Shiga toxin-encoding prophage induction and subsequent toxin release. For this purpose, 35 EHEC from the collection of the University of Milan were screened for the production of infectious Shiga toxin-encoding bacteriophages by end-point PCR and Spot test. The selected bacteria were profiled by RAPD-PCR, serotyping and virulence gene assessments and their infecting bacteriophages by RAPD-PCR and presence of Shiga toxinencoding gene assessments. Bacteriophage enumeration was performed by “Double Layer” assays, and an alternate technique based on recombinant plasmid cloning was designed and assayed. Lastly, the selected bacteria were submitted to varying concentrations of sodium chloride and lactic acid; to pasteurization treatment, UV irradiation and oxygen deprivation; and to the addition of ciprofloxacin, nalidixic acid and norfloxacin. Shiga toxin-encoding prophage induction by these stressors was assessed by real time quantitative PCR of stx1 gene subunit A. Three strains were selected, belonging to O26, O111 and an unknown serogroup. Every strain harboured at least a stx1a-prophage, and two of them harboured stx2a-prophages as well. The RAPD profiles of two bacteria and their respective infecting phage consortia were similar, indicating a close phylogenetic relation between the two bacteria and respective phages. Sodium chloride and UV irradiation increased prophage induction the most, whereas lactic acid had a significant repressing effect.
Escherichia coli produtora de toxina Shiga, ou STEC, é um agente patogénico de origem alimentar de dose infeciosa reduzida implicado em doenças como o síndrome hemolítico urémico, colite hemorrágica e diarreia sanguinolenta. Sendo um grupo de toxinas diversificado cujos genes codificantes estão contidos no genoma de bacteriófagos lambdoides, as toxinas Shiga são os fatores de virulência de maior importância associados a STEC. A atividade tóxica destas toxinas é devida à sua incidência sobre pequenos vasos sanguíneos de órgãos tais como rins, causando apoptose celular. Anualmente, à escala mundial, é estimado que 3 milhões de casos de doença sejam causados por infeções de STEC. Depois dos produtos cárneos, o leite e seus derivados são a fonte predominante responsável por surtos de STEC. Dado que o gado bovino, ovino, caprino e suíno são o reservatório primário destas estirpes infeciosas e que a fonte primária de contágio é a contaminação por matéria fecal de géneros alimentícios e recursos hídricos, algumas preocupações quanto à boa-implementação de medidas de segurança alimentar são levantadas. Em Itália, o queijo é um laticínio bastante consumido, tendo uma contribuição para a economia do país muito significativa. Em consequência de um aumento tendencial de surtos de STEC, relatado pela Autoridade Europeia de Segurança Alimentar (EFSA), nesta dissertação foi estudado o efeito de vários estímulos, a que as bactérias STEC possam estar expostas aquando da manufatura de queijo, e que podem induzir profagos portadores de genes codificantes para as toxinas Shiga, e, por conseguinte, a secreção destas toxinas. Assim, 35 estirpes de EHEC, provindas da coleção da Universidade de Milão, foram triadas a favor da produção de bacteriófagos infeciosos, portadores de genes codificantes para toxinas Shiga, por ensaios de PCR e “Spot test”. As bactérias selecionadas foram caracterizadas de acordo com os perfis RAPD-PCR, determinação de serotipo e deteção de genes de virulência, enquanto os respetivos bacteriófagos infeciosos forma identificados tendo por base os perfis RAPD-PCR e a deteção de genes codificantes para as toxinas Shiga. A caracterização viral foi alcançada recorrendo a ensaios “Double Layer”. Adicionalmente, uma técnica alternativa foi desenvolvida e testada, com base na clonagem de vetores plasmídeos recombinantes. Por fim, as bactérias selecionadas foram submetidas a concentrações variadas de cloreto de sódio e ácido lático; a tratamento por pasteurização, irradiação UV e privação de oxigénio; e a adição de ácido nalidíxico, ciprofloxacina e norfloxacina. Eventos de indução profágica despoletados pelos fatores referidos foram avaliados por amplificação da subunidade A do gene stx1 por PCR quantitativa em tempo real.Três estirpes foram selecionadas, pertencendo aos serogrupos O26 e O111 e a um serogrupo indeterminado. Em cada estirpe foi detetado pelo menos um profago portador do gene stx1a, em dois destes profagos foi ainda encontrado o gene stx2a. Os perfis RAPD de duas das três estirpes e os dos seus consórcios fágicos foram considerados idênticos, indicando uma relação filogenética próxima entre as duas estirpes e respetivos fagos. O cloreto de sódio e a irradiação UV estimularam eventos de indução profágica, em contraste com o ácido lático que reprimia significativamente a indução
Description: Dissertação apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Alimentar
URI: http://hdl.handle.net/10348/10669
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:DGB - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

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