Enlightening the complex sex determination and differentiation of zebrafish (Danio rerio)
Data
2016-05-04
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Zebrafish (Danio rerio), a freshwater teleost, is extensively used as model organism in research. However, how sex is determined in this species is a long-standing question. Current knowledge indicates that zebrafish sex determination (SD) has a polygenic genetic basis (GSD), although environmental sex determination (ESD) mechanisms may also be involved. In fact, several ESD factors, such as temperature, or environmental contaminants, like endocrine disrupting chemicals (EDCs), are known to perturb SD and induce sex-bias in zebrafish. Nevertheless, the study of interactions between factors that model SD has deserved low attention. Regarding to gonad differentiation, zebrafish is classified as an undifferentiated gonochoristic, with all individuals developing an immature ovary during early life stages. As to the development of males, there are evidences that apoptosis is involved in the process of “juvenile ovary” to testis transformation. In this context, this THESIS general aims were: 1) to gather evidences of GSD and to study how ESD drive zebrafish sexual differentiation and gonad development; 2) to better understand the role of apoptosis pathways in gonad development and if EDCs interfere with this process. Regarding zebrafish GSD, the existence of sex-associated regions was evaluated using ISSRs (Inter Simple Sequence Repeats) and RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) methodologies. These allowed identifying three potential sex-associated regions, DrSM_F1, DrSM_F2 and DrSM_M, which in the used zebrafish population recognized 80% of the males (DrSM_M) and 100% of the females (DrSM_F1+DrSM_F2). To assess how environmental factors (EDCs and temperature) may interfere with zebrafish gonads development a stereological approach was performed at light microscopy level. For this purpose zebrafish were exposed to a synthetic estrogen (EE2-17α-ethinylestradiol, 4 ng/L), an aromatase inhibitor (Fad-fadrozole, 50 μg/L), or to their binary mixture (Mix-EE2+ Fad, 4 ng/L + 50 μg/L). The exposure went from 2 hours to 90 days postfertilization (dpf) followed by, a subsequent recovery period up to 150 dpf to assess the reversibility of effects. The results showed that the concentration of EE2 used did not induce a sex-biased population but delayed the maturation of testes, while in ovaries this xenoestrogen acted as a maturation promoter. When combined with Fad (Mix), the latter neutralized the body weight and gonad volume gains induced by EE2 in males, while in the few females of this group the EE2 growth promoter effect was observed. The exposure to the EDCs, either singly or combined, promoted pathological alterations in the gonads of both genders. Alterations induced by EE2 were partially reversible after a recovery period, while both Fad and the Mix exposures permanently disrupted the sexual development of zebrafish, inducing masculinization and severe pathological alterations in testis, such as intersex. These results clearly showed that the aromatase inhibitor fadrozole overlapped the effect of the xenoestrogen EE2. EE2 effects at different water temperatures (23 and 33 ºC) were additionally studied in an assay performed between 2 hours and 60 dpf. While on one hand the lower water temperature (23 ºC) did not have an effect on zebrafish sex ratio, in the other hand it delayed considerably body growth and gonad differentiation and maturation. Furthermore, when zebrafish were maintained at the high water temperature (33 ºC), sex ratio was skewed toward males. However, when zebrafish were exposed to EE2 at 33 ºC, sex ratio was apparently skewed towards females, resulting from a delay on male gonads development. Finally, apoptosis pathways were studied at 35 dpf, during zebrafish gonad differentiation, tackling how EE2 and Fad exposures could interfere with them. This approach was performed by evaluating apoptosis genes (qRT-PCR) and proteins (immunohistochemistry) expression. Based on the obtained results, it was proposed a model for the apoptotic pathways involved in zebrafish gonad differentiation/development. In females it was identified the involvement of anti-apoptotic pathways, essential to maintain oocyte development, while pro-apoptotic proteins were predominant in male gonads, contributing to the failure of the “juvenile ovary” development and allowing its transformation into testes. Regarding the exposures to the selected EDCs, these seemed to increase apoptosis and induce responses of resistance to their action. In particular, genetic females exposed to Fad increased the anti-apoptotic genes/proteins, therefore counteracting the masculinizing action of this compound. On the contrary, males exposed to EE2 up-regulated pro-apoptotic genes/proteins in order to continue gonad differentiation. All together, results revealed the existence of two processes of gonad differentiation in zebrafish males, adding new evidences to consider when studying this species sex differentiation. In fact, it was shown herein that a large portion of males do not go through the “juvenile ovary” stage, presenting an insignificant number of primary oocytes at that age. In summary, this THESIS showed that zebrafish gonad differentiation is a more complex process than previously thought. It further evidenced that zebrafish sexual development is, but not always, susceptible to disruption by extrinsic factors, namely EDCs and temperature, and that there are differences between male and female genomes. The facts displayed herein support that sex determination on this species is primarily genetic but that it its strongly influenced by environmental factors.
O peixe-zebra (Danio rerio) é um peixe teleósteo muito utilizado como organismo modelo em investigação científica. No entanto, a sua determinação sexual continua a ser um processo pouco elucidado. As evidências, à luz do conhecimento atual, indicam que a determinação sexual do peixe-zebra tem uma base poligénica (genetic sex determination - GSD), embora o ambiente (environmental sex determination - ESD) também possa influenciar a determinação sexual. De facto, vários fatores ambientais, tais como a temperatura ou a exposição a contaminantes ambientais, em particular a compostos desreguladores endócrinos (CDEs), têm sido relacionados com perturbações do processo de determinação sexual e desequilíbrio do rácio sexual em peixe-zebra. Contudo, as interações entre fatores que influenciam a determinação sexual desta espécie têm sido pouco estudadas. Relativamente ao processo de diferenciação das gónadas, o peixe-zebra é classificado como gonocórico indiferenciado, em que todos os indivíduos desenvolvem um ovário imaturo durante as fases iniciais de desenvolvimento da gónada. No caso da diferenciação dos machos existem evidências de que mecanismos de apoptose estão envolvidos no processo de transformação do “ovário juvenil” em testículo. Neste contexto, esta TESE teve como objetivos: 1) reunir evidências de mecanismos genéticos e estudar como fatores ambientais interferem com a diferenciação sexual e o desenvolvimento das gónadas de peixe-zebra; 2) compreender o papel das vias de apoptose no desenvolvimento das gónadas e se a exposição a CDEs interfere com este processo. Em relação aos mecanismos genéticos de determinação sexual, a existência de regiões associadas ao género foi estudada usando ISSRs (Inter Simple Sequence Repeats) e RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA). Estes permitiram identificar três potenciais regiões associadas ao sexo, DrSM_F1, DrSM_F2 e DrSM_M, que na população de peixe-zebra estudada permitiram identificar 80% dos machos (DrSM_M) e 100% das fêmeas (DrSM_F1+DrSM_F2). De forma a estudar como o desenvolvimento das gónadas de peixe-zebra pode ser alterado por fatores ambientais (exposição a CDEs e temperatura), foi realizada uma análise estereológica em microscopia óptica. Com este propósito, peixes-zebra foram expostos a um estrogénio sintético (EE2-17α-etinilestradiol, 4 ng/L), a um inibidor da aromatase (Fadfadrozole, 50 μg/L), ou à mistura destes dois compostos (Mix-EE2+ Fad, 4 ng/L + 50 μg/L). A exposição foi realizada entre as 2 horas e os 90 dias pós-fertilização (dpf), tendo sido seguida de um período de recuperação até aos 150 dpf para avaliação da reversibilidade dos efeitos induzidos. Os resultados obtidos mostraram que a concentração de EE2 utilizada não alterou o rácio sexual da população exposta, contudo atrasou o desenvolvimento testicular e promoveu a maturação dos ovários. Quando combinado com fadrozole (Mix), o aumento de peso e de volume das gónadas induzido por este xenoestrogénio em machos foi anulado, no entanto o efeito como promotor de crescimento foi observado nas fêmeas deste grupo. Alterações patológicas das gónadas, em ambos os sexos, foram observadas após a exposição aos dois CDEs, quando isolados ou combinados. As alterações induzidas pelo EE2, após um período de recuperação, mostraram ser parcialmente reversíveis, enquanto as exposições ao Fad e à Mix alteraram permanentemente o desenvolvimento sexual de peixe-zebra, ao induzir masculinização e alterações patológicas pronunciadas no testículo, como por exemplo intersexo. Estes resultados mostraram claramente que os efeitos induzidos pelo inibidor da aromatase fadrozole se sobrepuseram aos efeitos do xenoestrogénio EE2. Adicionalmente, os efeitos da exposição ao EE2 a diferentes temperaturas (23 e 33 ºC) foram também analisados num ensaio efetuado entre as 2 horas e os 60 dpf. A temperatura mais baixa (23 ºC) não induziu alteração do rácio sexual, no entanto atrasou consideravelmente o crescimento e a diferenciação e maturação das gónadas. Contudo, quando o peixe-zebra foi mantido à temperatura mais alta (33 ºC), o rácio sexual do grupo foi desviado, ocorrendo um aumento da proporção de machos. Quando os peixes-zebra foram simultaneamente expostos a EE2 e mantidos a 33 ºC, o rácio sexual foi aparentemente desviado no sentido das fêmeas, sendo este resultado devido a ter ocorrido um atraso no desenvolvimento das gónadas masculinas. Por fim durante o período de diferenciação da gónada de peixe-zebra (35 dpf) foram estudadas as vias da apoptose e como as exposições a EE2 e Fad podem interferir com essas vias. Este estudo foi efetuado através da avaliação da expressão de genes (qRT-PCR) e proteínas (immunohistoquímica) envolvidos no processo de apoptose. Com base nos resultados obtidos, foi proposto um modelo das vias de apoptose envolvidas na diferenciação/desenvolvimento das gónadas de peixe-zebra. Nas fêmeas foi identificado o envolvimento de vias anti-apoptóticas, essenciais para a manutenção do desenvolvimento dos oócitos. Enquanto nos machos foram observadas predominantemente proteínas proapoptóticas, que contribuíram para a interrupção do desenvolvimento do “ovário juvenil” e permitiram a transformação em testículo. Relativamente ao efeito das exposições aos CDEs selecionados, estes compostos parecem ter aumentado a apoptose e induzido respostas de resistência à sua ação. Em particular, as poucas fêmeas genotípicas do grupo exposto ao Fad apresentaram um aumento dos genes/proteínas anti-apoptóticas, que permitiu contrariar a ação masculinizante deste composto. Pelo contrário, os machos expostos ao EE2 aumentaram os genes/proteínas pro-apoptóticos de forma a permitir o prosseguimento do processo de diferenciação da gónada masculina. No conjunto, os resultados revelaram a existência de dois processos de diferenciação da gónada masculina de peixe-zebra, adicionando novas evidências que devem ser tidas em consideração quando se estuda a diferenciação sexual desta espécie. De facto, neste estudo foi mostrado que uma grande proporção de machos não passa pela fase de “ovário juvenil”, apresentando um número insignificante de oócitos primários durante essa fase de desenvolvimento. Em resumo, esta TESE mostrou que a diferenciação da gónada de peixe-zebra é um processo ainda mais complexo do que previamente considerado. Adicionalmente, evidenciou que o desenvolvimento sexual desta espécie é, mas nem sempre, suscetível de sofrer alterações induzidas por fatores extrínsecos, nomeadamente CDEs e temperatura, e que existem diferenças entre o genoma masculino e feminino. Os resultados expostos suportam que a determinação sexual desta espécie é principalmente regulada por fatores genéticos, contudo este processo é fortemente influenciado por fatores ambientais.
O peixe-zebra (Danio rerio) é um peixe teleósteo muito utilizado como organismo modelo em investigação científica. No entanto, a sua determinação sexual continua a ser um processo pouco elucidado. As evidências, à luz do conhecimento atual, indicam que a determinação sexual do peixe-zebra tem uma base poligénica (genetic sex determination - GSD), embora o ambiente (environmental sex determination - ESD) também possa influenciar a determinação sexual. De facto, vários fatores ambientais, tais como a temperatura ou a exposição a contaminantes ambientais, em particular a compostos desreguladores endócrinos (CDEs), têm sido relacionados com perturbações do processo de determinação sexual e desequilíbrio do rácio sexual em peixe-zebra. Contudo, as interações entre fatores que influenciam a determinação sexual desta espécie têm sido pouco estudadas. Relativamente ao processo de diferenciação das gónadas, o peixe-zebra é classificado como gonocórico indiferenciado, em que todos os indivíduos desenvolvem um ovário imaturo durante as fases iniciais de desenvolvimento da gónada. No caso da diferenciação dos machos existem evidências de que mecanismos de apoptose estão envolvidos no processo de transformação do “ovário juvenil” em testículo. Neste contexto, esta TESE teve como objetivos: 1) reunir evidências de mecanismos genéticos e estudar como fatores ambientais interferem com a diferenciação sexual e o desenvolvimento das gónadas de peixe-zebra; 2) compreender o papel das vias de apoptose no desenvolvimento das gónadas e se a exposição a CDEs interfere com este processo. Em relação aos mecanismos genéticos de determinação sexual, a existência de regiões associadas ao género foi estudada usando ISSRs (Inter Simple Sequence Repeats) e RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA). Estes permitiram identificar três potenciais regiões associadas ao sexo, DrSM_F1, DrSM_F2 e DrSM_M, que na população de peixe-zebra estudada permitiram identificar 80% dos machos (DrSM_M) e 100% das fêmeas (DrSM_F1+DrSM_F2). De forma a estudar como o desenvolvimento das gónadas de peixe-zebra pode ser alterado por fatores ambientais (exposição a CDEs e temperatura), foi realizada uma análise estereológica em microscopia óptica. Com este propósito, peixes-zebra foram expostos a um estrogénio sintético (EE2-17α-etinilestradiol, 4 ng/L), a um inibidor da aromatase (Fadfadrozole, 50 μg/L), ou à mistura destes dois compostos (Mix-EE2+ Fad, 4 ng/L + 50 μg/L). A exposição foi realizada entre as 2 horas e os 90 dias pós-fertilização (dpf), tendo sido seguida de um período de recuperação até aos 150 dpf para avaliação da reversibilidade dos efeitos induzidos. Os resultados obtidos mostraram que a concentração de EE2 utilizada não alterou o rácio sexual da população exposta, contudo atrasou o desenvolvimento testicular e promoveu a maturação dos ovários. Quando combinado com fadrozole (Mix), o aumento de peso e de volume das gónadas induzido por este xenoestrogénio em machos foi anulado, no entanto o efeito como promotor de crescimento foi observado nas fêmeas deste grupo. Alterações patológicas das gónadas, em ambos os sexos, foram observadas após a exposição aos dois CDEs, quando isolados ou combinados. As alterações induzidas pelo EE2, após um período de recuperação, mostraram ser parcialmente reversíveis, enquanto as exposições ao Fad e à Mix alteraram permanentemente o desenvolvimento sexual de peixe-zebra, ao induzir masculinização e alterações patológicas pronunciadas no testículo, como por exemplo intersexo. Estes resultados mostraram claramente que os efeitos induzidos pelo inibidor da aromatase fadrozole se sobrepuseram aos efeitos do xenoestrogénio EE2. Adicionalmente, os efeitos da exposição ao EE2 a diferentes temperaturas (23 e 33 ºC) foram também analisados num ensaio efetuado entre as 2 horas e os 60 dpf. A temperatura mais baixa (23 ºC) não induziu alteração do rácio sexual, no entanto atrasou consideravelmente o crescimento e a diferenciação e maturação das gónadas. Contudo, quando o peixe-zebra foi mantido à temperatura mais alta (33 ºC), o rácio sexual do grupo foi desviado, ocorrendo um aumento da proporção de machos. Quando os peixes-zebra foram simultaneamente expostos a EE2 e mantidos a 33 ºC, o rácio sexual foi aparentemente desviado no sentido das fêmeas, sendo este resultado devido a ter ocorrido um atraso no desenvolvimento das gónadas masculinas. Por fim durante o período de diferenciação da gónada de peixe-zebra (35 dpf) foram estudadas as vias da apoptose e como as exposições a EE2 e Fad podem interferir com essas vias. Este estudo foi efetuado através da avaliação da expressão de genes (qRT-PCR) e proteínas (immunohistoquímica) envolvidos no processo de apoptose. Com base nos resultados obtidos, foi proposto um modelo das vias de apoptose envolvidas na diferenciação/desenvolvimento das gónadas de peixe-zebra. Nas fêmeas foi identificado o envolvimento de vias anti-apoptóticas, essenciais para a manutenção do desenvolvimento dos oócitos. Enquanto nos machos foram observadas predominantemente proteínas proapoptóticas, que contribuíram para a interrupção do desenvolvimento do “ovário juvenil” e permitiram a transformação em testículo. Relativamente ao efeito das exposições aos CDEs selecionados, estes compostos parecem ter aumentado a apoptose e induzido respostas de resistência à sua ação. Em particular, as poucas fêmeas genotípicas do grupo exposto ao Fad apresentaram um aumento dos genes/proteínas anti-apoptóticas, que permitiu contrariar a ação masculinizante deste composto. Pelo contrário, os machos expostos ao EE2 aumentaram os genes/proteínas pro-apoptóticos de forma a permitir o prosseguimento do processo de diferenciação da gónada masculina. No conjunto, os resultados revelaram a existência de dois processos de diferenciação da gónada masculina de peixe-zebra, adicionando novas evidências que devem ser tidas em consideração quando se estuda a diferenciação sexual desta espécie. De facto, neste estudo foi mostrado que uma grande proporção de machos não passa pela fase de “ovário juvenil”, apresentando um número insignificante de oócitos primários durante essa fase de desenvolvimento. Em resumo, esta TESE mostrou que a diferenciação da gónada de peixe-zebra é um processo ainda mais complexo do que previamente considerado. Adicionalmente, evidenciou que o desenvolvimento sexual desta espécie é, mas nem sempre, suscetível de sofrer alterações induzidas por fatores extrínsecos, nomeadamente CDEs e temperatura, e que existem diferenças entre o genoma masculino e feminino. Os resultados expostos suportam que a determinação sexual desta espécie é principalmente regulada por fatores genéticos, contudo este processo é fortemente influenciado por fatores ambientais.
Descrição
Tese para ao candidatura ao grau de Doutor em Ciências Químicas e Biológicas na Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Palavras-chave
Danio rerio , gonad