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Title: Interaction between microplastics and copper: toxicity assessment in zebrafish (Danio rerio) and blackspot seabream (Pagellus bogaraveo)
Authors: Santos, Dércia Cabral dos
Advisor: Monteiro, Sandra Mariza Veiga
Bellas Bereijo, Juan
Keywords: Peixes
Microplásticos
Issue Date: 30-Sep-2022
Abstract: Nas últimas décadas, os resíduos de plástico têm sido globalmente reconhecidos como um poluente emergente, com potenciais efeitos negativos sobre os organismos aquáticos e na saúde humana. Embora o tamanho dos plásticos no ambiente aquático varie de pequenas partículas a fragmentos de maiores dimensões ou macroplásticos, atualmente, os microplásticos (MPs) que têm despertado mais atenção. Os MPs, ou seja, partículas sintéticas com formato regular ou irregular e tamanho compreendido entre 1 μm e 5 mm, têm sido reconhecidos como ubíquos nos ecossistemas, persistentes e potencialmente tóxicos para os organismos aquáticos. Devido ao seu pequeno tamanho, elevada área de superfície e hidrofobicidade, os MPs podem adsorver e acumular outros poluentes, como o cobre (Cu), um metal pesado que representa um risco significativo para o ambiente aquático. Por sua vez, quando os MPs interagem com os organismos aquáticos, a biodisponibilidade e toxicidade dos metais pesados adsorvidos pode ser modulada. No entanto, a investigação sobre os efeitos combinados de MPs e metais pesados, nos organismos aquáticos ainda é limitada. Neste contexto, o trabalho desenvolvido nesta TESE tem como principal objetivo avaliar os efeitos toxicológicos de MPs e Cu, isolados ou combinados, em duas espécies de peixes, nomeadamente o peixe-zebra (Danio rerio) e o goraz (Pagellus bogaraveo), contribuindo com novas evidências sobre os impactos ambientais dos MPs nos organismos aquáticos de água doce e marinha. Considerando as limitações atuais de conhecimento sobre os efeitos dos MPs e do Cu em diferentes estágios de vida dos peixes, ou após exposições prolongadas, várias abordagens experimentais foram selecionadas. Peixes-zebra foram expostos a MPs (2 mg/L) e Cu (15 – 125 μg/L, diferentes concentrações de acordo com o bioensaio), isolados ou combinados, desde as 2 horas pós-fertilização (hpf) até às 96 hpf (exposição aguda) ou aos 14 dias pós-fertilização (dpf) (exposição subcrónica), para avaliar, respectivamente, os efeitos independentes ou dependentes da ingestão destes poluentes no desenvolvimento embrionário dos peixes. Similarmente, uma exposição crónica de 30 dias, a MPs (2 mg/L) e Cu (25 μg/L), isoladamente ou combinados, foi realizada em peixes-zebra adultos para avaliar os efeitos de uma exposição prolongada em idade adulta. Adicionalmente, foi realizada uma exposição aguda e subcrónica (3 e 9 dias), a MPs (0,3 mg/L) e Cu (10 – 810 μg/L), isoladamente ou combinados, de larvas recém-eclodidas de goraz, uma espécie marinha, para avaliar o seu efeito nos estágios finais do desenvolvimento larvar. A exposição aguda induziu, em embriões de peixe-zebra, alguns efeitos tóxicos, nomeadamente a diminuição da sobrevivência e da eclosão, stress oxidativo, modulação do sistema antioxidante, inibição da acetilcolinesterase (AChE) e disrupção de comportamentos de aversão e sociais. No entanto, estes efeitos foram observados particularmente nos grupos expostos ao Cu e às misturas (Cu+MPs), não tendo a exposição isolada a MPs produzido efeitos significativos no peixe-zebra. Estes resultados mostram que a ação tóxica da exposição aguda aos MPs, durante o período embrionário, pode ser limitada, possivelmente devido à presença do córion que atua como uma barreira protetora contra os poluentes. Quando expostos subcronicamente, durante 14 dias, observou-se que os MPs e as misturas Cu+MPs tiveram maior efeito tóxico nas larvas de peixe-zebra, em comparação com a exposição aguda, sugerindo que a toxicidade das partículas de plástico pode surgir após exposições mais longas e estar ainda relacionada com a sua ingestão. Em resumo, os resultados da exposição subcrónica mostraram que os MPs e Cu, isolados ou combinados, causaram uma elevada mortalidade, stress oxidativo e neurotoxicidade nas larvas de peixe-zebra. Em relação aos efeitos associados à neurotoxicidade, foi observada uma inibição da atividade da AChE e uma diminuição da expressão de genes relacionados com a proliferação neuronal (sox2, pcna), neurogénese (neuroD, olig2), desenvolvimento dos neurónios motores (islet) e DNA metiltransferases. Por sua vez, estes efeitos tóxicos podem ter contribuído para as alterações comportamentais observadas ao nível da competência locomotora e escape a predadores, nas larvas de peixe-zebra expostas a MPs, Cu e Cu+MPs. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos crónicos dos MPs e Cu em peixes-zebra adultos, particularmente em dois principais órgãos-alvo – brânquias e cérebro. Nas brânquias, foi observado um aumento dos níveis de espécies reativas de oxigénio (ROS), com a consequente a indução de stress oxidativo, bem como um aumento da expressão de genes relacionados com a síntese de serotonina e apoptose. Em relação aos efeitos no cérebro do peixe-zebra, não foram observados sinais de indução de stress oxidativo. Porém, notou-se um aumento da atividade da AChE em todos os grupos expostos, alterações na expressão génica relacionada com a neurogénese adulta, sistema dopaminérgico e apoptose, bem como alterações no comportamento locomotor e social dos peixes. Estes resultados, por sua vez, destacam as diferentes interações dos MPs e Cu em diferentes órgãos. Por fim, a exposição aguda e subcrónica do goraz a MPs e Cu, provocou stress oxidativo, dano celular e modulação do sistema antioxidante. À semelhança do observado em peixe-zebra, uma espécie de água doce, os resultados demonstraram também no goraz, uma espécie marinha, que a toxicidade dos MPs em fases embrionárias e larvares surge principalmente após exposições mais longas. No entanto, ao contrário do peixe-zebra onde os MPs e Cu, isolados ou combinados, desregularam a atividade da AChE e a proliferação neuronal, no goraz não foram observados tais efeitos neurotóxicos. Isto, por sua vez, indica que a resposta dos peixes aos MPs e Cu é também dependente da espécie. De uma forma geral, os resultados evidenciam que a exposição a MPs e Cu, isoladamente ou combinados, pode promover toxicidade no desenvolvimento, stress oxidativo e dano celular, alterações em termos de atividade metabólica, neurotoxicidade e comportamental. Os dados aqui apresentados proporcionam um conhecimento mais aprofundado sobre as interações toxicológicas dos MPs e metais pesados em peixes, principalmente em fases iniciais de vida. Esta TESE enfatiza que novas pesquisas sobre os efeitos dos MPs, isolados ou combinados com outros poluentes, devem incluir exposições mais prolongadas para avaliar adequadamente o potencial risco das partículas de plástico na saúde dos organismos.
In the last decades, plastic litter has gained global recognition as an emerging pollution problem with putative harmful effects on aquatic biota and human health. Although the size of plastic litter in the aquatic environment ranges from small particles to large fragments or macroplastics, it is now microplastics (MPs) that receive more attention. MPs, i.e. synthetic particles with regular or irregular shape and size between 1 μm and 5 mm, have been recognized as ubiquitous in ecosystems worldwide, persistent, and potentially toxic to aquatic organisms. Due to its small size, high surface area, and hydrophobicity, MPs can easily adsorb and accumulate other waterborne pollutants, such as copper (Cu), which is a heavy metal of great concern. In turn, when MPs interact with aquatic biota, the bioavailability of heavy metals adsorbed to their surface can be altered, and their toxicity can be modulated. Nevertheless, the research regarding the effects of MPs and heavy metals in aquatic biota is still limited. In this context, this THESIS aimed to assess the toxicological effects of MPs and Cu, alone or combined, in two fish species, the zebrafish (Danio rerio) and the blackspot seabream (Pagellus bogaraveo), and provide novel insights regarding the environmental impacts of MPs in freshwater and marine biota. Considering the knowledge gap regarding the MPs and Cu effects in different fish life stages, especially after longer exposures, several experimental approaches were chosen. Zebrafish were exposed to MPs (2 mg/L) and Cu (15 – 125 μg/L, different concentrations depending on the type of bioassay used), alone or combined, from 2 hours post-fertilization (hpf) until 96 hpf (acute exposure) or 14 days post-fertilization (dpf) (subchronic exposure), to evaluate, respectively, the non-feeding or the feeding effects of these pollutants on fish development. Likewise, chronic 30-day exposure, to MPs (2 mg/L) and Cu (25 μg/L), alone or combined, was performed in zebrafish adults to evaluate the long-term effects at later ages. Additionally, in the marine species blackspot seabream, acute and subchronic exposure (3 and 9 days) to MPs (0.3 mg/L) and Cu (10 – 810 μg/L), alone or combined, was performed in newly hatched larvae to cover the late stages of larval development. In the acute bioassay, performed on zebrafish embryos, toxic effects such as decreased survival and hatching, oxidative stress, modulation of the antioxidant system, inhibition of acetylcholinesterase (AChE), and disruption of avoidance and social behaviors, were observed. Nevertheless, these effects were mostly noticed in Cu and mixture (Cu+MPs) exposed groups, with MPs alone not producing significant effects on zebrafish. These results show that the toxic effects of acute exposure to MPs, during the embryonic period, can be limited, possibly due to the presence of the chorion which acts as a protective barrier against pollutants. When exposed subchronically, during 14 days, it was observed that MPs alone and Cu+MPs had a higher toxic effect on zebrafish larvae, compared to the acute exposure, highlighting that the toxicity of plastic particles may arise after longer exposures and could also be related to the ingestion of the plastic particles. Briefly, the subchronic exposure data showed that MPs and Cu, alone or combined, caused high mortality, oxidative stress, and neurotoxicity in zebrafish larvae. Regarding the specific effects related to neurotoxicity, inhibition of AChE and downregulation of neuronal proliferation (sox2, pcna), neurogenesis (neuroD, olig2), motor neurons development (islet), and DNA methyltransferases-related genes, were observed. In turn, these toxic effects may have contributed to the behavioral alterations, such as disruption of locomotor competence and avoidance behavior, observed in zebrafish larvae exposed to MPs, Cu and Cu+MPs. Additionally, the chronic effects of MPs and Cu were evaluated on adult zebrafish, particularly on two main target organs – gills and brain. In gills, there was an increase of reactive oxygen species (ROS) and, consequently, the induction of oxidative stress, as well an upregulation of serotonin and apoptosis-related genes. Regarding the effects on zebrafish brain, the induction of oxidative stress was not observed; however, an increase in AChE activity was noticed in all exposed groups, as well as alterations in adult neurogenesis, dopaminergic system and apoptosis-related genes, and, consequently, changes in the locomotor and social behavior of fish. These effects, in turn, highlight the different interactions of MPs and Cu with different organs. Finally, in the acute and subchronic exposure of blackspot seabream to MPs and Cu, where oxidative stress, cellular damage, and modulation of the antioxidant system were observed, the results showed again that MPs toxicity in early life stages arises mostly after longer exposures. Nevertheless, contrarily to zebrafish where MPs and Cu, alone or combined, induced disruption of AChE activity and neuronal proliferation, no such neurotoxic effects were observed in blackspot seabream. This indicates that the response of fish to MPs and Cu is also species-dependent. Overall, the results provide evidence that exposure to MPs and Cu, alone or combined, can promote developmental toxicity, oxidative stress and cellular damage, alterations in terms of metabolic activity, neurotoxicity, and disruption of fish behavior, crucial for their survival in the environment. The data presented herein provide deeper insights into MPs and heavy metals toxicological interactions in fish, particularly in early life stages. This THESIS emphasizes that further research on the effects of MPs, alone or combined with other pollutants, should include longer exposures to properly evaluate the potential risk of plastic particles to the organisms' health condition.
Description: Dissertation presented to obtain the Ph.D. degree in Science, Technology and Management of the Sea (Do*Mar), at the Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, under the supervision of Sandra Mariza Veiga Monteiro, Ph.D. and Assistant Professor at the Departamento de Biologia e Ambiente (DeBA) in the Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro; and Juan Bellas Bereijo, Ph.D and Research Professor at the Instituto Espanhol de Oceanografia (IEO, CSIC), in the Centro Oceanográfico de Vigo.
URI: http://hdl.handle.net/10348/11381
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:DEBA - Teses de Doutoramento

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