New fluorescence-based biosensor for SARS-CoV-2 detection

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2022-04-05
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Resumo
A pandemia de COVID-19, causada pelo vírus SARS-CoV-2, resultou, até agora, em mais de 375 milhões de indivíduos infetados e 5,5 milhões de mortes em todo o mundo. Nos últimos dois anos os seus efeitos sentiram-se no setor económico, social e da saúde, e as suas consequências são incalculáveis. Embora a vacinação já esteja a decorrer em vários países, a gestão desta pandemia ainda depende fortemente de medidas preventivas como o distanciamento social, lavagem das mãos e uso de máscaras, mas também de uma testagem em massa eficaz. O desenvolvimento e otimização de métodos de deteção rápidos, sensíveis e económicos é extremamente importante para mitigar possíveis surtos, permitindo a identificação e isolamento dos indivíduos infetados. Atualmente, existem diversos testes de diagnósticos disponíveis no mercado, e técnicas como a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) e testes serológicos têm sido amplamente implementadas. No entanto, problemas como baixa especificidade e sensibilidade, alto custo, tempo de espera excessivo e falta de equipamentos e técnicos qualificados ainda precisam de ser abordados para garantir uma maior acessibilidade à população em geral. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método capaz de detetar o vírus SARS-CoV-2, de forma rápida, específica, altamente sensível e económica. Neste trabalho desenvolvemos um biossensor de fluorescência, baseado em nanopartículas de carbono. Este biossensor, que deteta a presença do RNA do vírus através da hibridação de sondas, utilizou como alvo diversas sequências do genoma, nomeadamente nos genes ORF1ab, E e N. Para avaliar a sensibilidade do biossensor utilizámos alvos sintéticos e amostras reais, em diferentes concentrações. Em relação à sua especificidade, testámos cada sonda com alvos sintéticos complementares e alvos sintéticos não complementares. Tanto os ensaios de sensibilidade como de especificidade apresentaram bons resultados. O desempenho do biossensor foi ainda validado com um elevado número de amostras nasofaríngeas, cujos resultados foram confirmados por um ensaio de RT-PCR. Conseguimos ainda obter resultados concretos em 15 amostras cujo resultado era inconclusivo no RT-PCR, o que é indicativo de uma elevada sensibilidade do biossensor. O biossensor desenvolvido permite a deteção de 3 sequências diferentes, em menos de 10 minutos, após a extração do RNA, à temperatura ambiente. O alto número de sequências detetadas é uma salvaguarda contra a possibilidade de falsos negativos, devido à possibilidade de existência de mutações na sequência alvo do genoma, o que atualmente é um problema com outros testes de diagnóstico de COVID-19. Além disso, o número de sondas e a respetiva sequência são facilmente adaptáveis, o que representa uma grande vantagem considerando a natureza evolutiva do vírus e o surgimento de novas variantes.
The current COVID-19 outbreak, caused by the SARS-CoV-2 virus, has resulted in more than 375 million of infected individuals and 5,5 million deaths worldwide. Over the last two years, its effects have rippled through the economic, social and health sectors, and its consequences are immeasurable. Although vaccination is already underway in several countries, the management of this pandemic still heavily relies on preventive measures such as social distancing, hand washing and the use of masks, but also in an effective mass testing. The development and optimization of fast, sensitive, and cost-effective detection methods is very important to mitigate any possible outbreaks by identifying and isolating the infected individuals. There are several diagnostics tests available in the market, and techniques such as Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and serology tests have been widely implemented. However, problems like low specificity and sensitivity, high cost, excessive waiting time and lack of equipment and qualified technicians still need to be addressed to assure an all-inclusive reliable accessibility. The objective of this work was to develop a method able to accurately detect the SARS-CoV-2 virus, in a fast, specific, highly sensitive and cost-effective way. We developed a fluorescence-based biosensor based on carbon nanoparticles. This biosensor, which detects the presence of the virus RNA through probe hybridization, used probes targeting several regions of the genome, in the ORF1ab, E and N genes. To assess the biosensor sensitivity, we used synthetic targets and real samples in a range of different concentrations. Regarding its specificity, we tested each probe against complementary synthetic targets and non-complementary synthetic targets. Both the sensitivity and specificity assays showed good results. The biosensor performance was further validated with a high number of human nasopharyngeal swabs samples, which results were confirmed with a RT-PCR assay. We also obtained concrete results in 15 samples, which were labelled as inconclusive in the RT-PCR assay, which indicates a higher sensitivity of the biosensor. The developed biosensor allows the detection of 3 different targets, in less than 10 minutes, after RNA extraction, at room temperature. The high number of targets is a safeguard against the possibility of false negative results, due to the existence of any mutations in the genome targeted sequence, which is becoming a problem with other COVID-19 diagnostic tests. Moreover, the number of probes and the respective sequence is easily adaptable, what represents a great advantage considering the evolving nature of the virus and the emergence of new variants.
Descrição
I declare, for all purposes, that this dissertation meets the technical and scientific standards required by the regulations of University of Trás-os-Montes and Alto-Douro. The presented ideas are the exclusive responsibility of the author
Palavras-chave
SARS-CoV-2 , Métodos de deteção
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