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Title: Vitamina A e agentes modeladores do desenvolvimento pulmonar
Authors: Pinto, Maria de Lurdes Ribeiro
Advisor: Bairos, Vasco
Rodrigues, Paula
Keywords: Pulmão
Desenvolvimento embrionário
Retinol (Vitamina A)
Issue Date: 2008
Abstract: A presente dissertação é o corolário de um conjunto de estudos desenvolvidos com o objectivo de contribuir para um melhor conhecimento dos efeitos da administração pré-natal de vitamina A sobre alguns dos mais importantes factores envolvidos na formação da rede vascular do pulmão. O estudo realizado está inserido no âmbito dos trabalhos que têm vindo a ser efectuados há mais de duas décadas no Instituto de Histologia e Embriologia da faculdade de Medicina de Coimbra, visando esclarecer os processos subjacentes à morfogénese, histogénese e histofisiologia pulmonares. O murganho, Mus musculus, estirpe ICR (CD-1®), foi utilizado como modelo experimental, tendo sido analisados os aspectos morfológicos da presença do VEGF, dos seus receptores (VEGFR), do Tie-2, da MMP-1, da MMP-9 e do TIMP-1 no pulmão de fetos e de recém-nascidos cuja gestação decorreu sob o efeito da vitamina. A. Nos mesmos animais, foi ainda realizado um estudo quantitativo da concentração pulmonar do VEGF e do Tie-2, a determinação da concentração plasmática do VEGF, bem como o estudo dos níveis de expressão genética do VEGFR-1 e do VEGFR-2. Em virtude da existência de dimorfismo sexual no pulmão adulto, foi considerado pertinente avaliar cada um dos parâmetros com separação por sexo Para um melhor enquadramento do trabalho experimental, e uma vez apresentados os objectivos que se pretenderam alcançar, procedeu-se à organização do presente trabalho em seis capítulos. Assim, no capítulo I, são revistos, de forma sucinta, o actual estado do conhecimento da morfogénese pulmonar e os aspectos mais relevantes da formação e organização do compartimento vascular do pulmão, procurando integrá-los na descrição dos períodos de desenvolvimento do órgão. No capítulo II são expostos os principais fundamentos teóricos que estiveram na base da investigação efectuada, constituindo esta o contributo pessoal de natureza experimental do presente trabalho, explanada do terceiro ao sexto capítulo. O capítulo III é dedicado ao estudo morfológico e quantitativo da presença do VEGF no pulmão fetal, desde o 15º dia de gestação até ao dia do nascimento, em animais a cujas mães foi administrada, por via subcutânea, uma dose única de vitamina A (45 000 UI, 150 µl). A determinação da concentração plasmática do VEGF foi igualmente apurada. Em paralelo foram estudados animais provenientes de gestantes às quais foi administrado o volume equivalente de placebo (grupos controlo). O estudo morfológico e semiquantitativo da presença do VEGF nos diferentes períodos do desenvolvimento pulmonar foi efectuado por imuno-histoquímica. Para a quantificação da concentração deste factor de crescimento no pulmão e no plasma, recorreu-se à metodologia de ELISA. A análise morfológica e a determinação da concentração pulmonar revelaram que, ao 15º dia de gestação, o VEGF está presente em maior quantidade no pulmão de fetos controlo. Nestes animais, a imunorreactividade para o VEGF é muito intensa, podendo ser observada no citoplasma das células mesenquimatosas e das células que revestem o componente canalicular do pulmão, bem como na matriz extracelular. Contudo, nos fetos provenientes de mães às quais foi administrada vitamina A, a concentração plasmática deste factor de crescimento é superior à dos fetos controlo. No período canalicular, 16º dia de gestação, e nos períodos subsequentes do desenvolvimento pulmonar, há um aumento progressivo do VEGF no pulmão dos fetos submetidos ao efeito da vitamina A, acompanhado de um decréscimo da concentração plasmática deste factor de crescimento. Pelo contrário, nos fetos controlo observa-se uma oscilação dos valores da concentração pulmonar e um aumento sustentado da concentração plasmática do VEGF ao longo do período fetal em estudo. No dia do nascimento, a concentração pulmonar e plasmática do VEGF, bem como o padrão de imuno-expressão deste factor são equivalentes nos animais sujeitos ao efeito da vitamina A e nos animais controlo. É ainda de salientar que, no último grupo, os animais do sexo feminino apresentam uma concentração pulmonar do VEGF superior, especialmente no dia que antecede o nascimento. Os resultados obtidos indicam que a administração pré-natal vitamina A influencia os teores pulmonares e plasmáticos do VEGF, com uma aparente acção sinergética entre ambos os compostos, importantes factores morfogenéticos capazes de contribuir para a aceleração do processo de desenvolvimento pulmonar fetal, processo este que será mais precoce nos indivíduos do sexo feminino. No capítulo IV procedeu-se ao estudo da imuno-expressão do Tie-2 e da quantificação, por ELISA, da concentração pulmonar deste receptor, um dos principais responsáveis pela remodelação e manutenção da estabilidade vascular, em animais controlo e animais cuja gestação decorreu sob a influência da vitamina A, desde o 15º dia de gestação até ao dia do nascimento. A imunomarcação do Tie-2 é muito semelhante ao longo de todo o período em estudo, podendo ser detectada quer no citoplasma e na membrana das células mesenquimatosas, quer nas células endoteliais e células musculares lisas da parede vascular de ambos os grupos examinados. A concentração pulmonar do Tie-2 atinge o valor máximo ao 15º dia de gestação, fim do período pseudoglandular, dia este em que os fetos controlo apresentam uma concentração mais elevada do que os fetos a cujas mães foi administrada vitamina A. Nos restantes dias avaliados os valores são inferiores e idênticos nos dois grupos em estudo. De forma análoga ao que se verifica em relação à concentração pulmonar do VEGF, também os fetos do sexo feminino do grupo controlo apresentam concentrações pulmonares do Tie-2 superiores às observadas nos fetos do sexo masculino ao 18º dia de gestação. Da análise destes resultados pode-se concluir que a vitamina A, na dose ministrada, não induz alterações significativas do Tie-2 a nível pulmonar. Pode ainda inferir-se que, em condições fisiológicas, e tendo igualmente em conta os resultados obtidos relativamente ao VEGF, há nos fetos do sexo feminino um estímulo acrescido da angiogénese no dia que antecede o nascimento. O estudo apresentado no capítulo V aborda os padrões morfológicos da distribuição dos receptores do VEGF, o VEGFR-1 e o VEGFR-2, bem como a expressão dos respectivos genes no pulmão de fetos e recém-nascidos desenvolvidos nas duas condições gestacionais mencionadas em parágrafos anteriores. Para tal, utilizaram-se as metodologias de imuno-histoquímica e de RT-PCR em tempo real. A quantidade de transcritos reflecte os resultados apurados através da avaliação semiquantitativa da imuno-expressão de ambos os receptores. O vegfr-1 é expresso em quantidade muito inferior à do vegfr-2, fazendo com que nos estadios mais precoces da morfogénese pulmonar, especialmente no período pseudoglandular (15º dia de gestação) e na fase inicial do período canalicular (16º dia de gestação), a imunorreactividade para este receptor esteja ausente na maioria dos fetos examinados. Nos restantes períodos do desenvolvimento pulmonar, a presença do VEGFR-1 e do VEGFR-2 pode observar-se nas células endoteliais e nas células musculares da parede vascular, bem como em algumas células epiteliais que revestem a porção canalicular do órgão. No período sacular, torna-se evidente a imunorreactividade dos referidos receptores nos pneumócitos de tipo II e de tipo I, entretanto diferenciados. O estudo morfológico efectuado revelou o predomínio da imunomarcação membranar em detrimento da citoplasmática, em concordância com a localização citológica dos receptores em causa. No pulmão dos animais a cujas mães foi adminstrada a vitamina A, registou-se um aumento dos níveis de expressão do vegfr-1 e do vegfr-2 a partir do período pseudoglandular (15º dia de gestação), alteração esta que se traduziu na existência de diferenças igualmente observáveis na imuno-expressão das respectivas proteínas. A separação dos animais de acordo com o sexo, permitiu ainda identificar uma tendência para a maior expressão do vegfr-1 em fetos e recém-nascidos do sexo feminino. O capítulo VI versa o estudo morfológico da ontogenia da MMP-1, da MMP-9 e de um dos seus principais inibidores tecidulares, o TIMP-1, mediante imuno¬histoquímica, no decorrer dos vários períodos de desenvolvimento pulmonar em estudo, quer em animais controlo, quer em animais submetidos ao efeito da vitamina. A. A imunorreactividade para a MMP-1 e para a MMP-9 é alvo de modificações ao longo da organogénese pulmonar, mas apenas a MMP-9 sofre alterações decorrentes da administração materna da vitamina A. Estas estão ausentes na imuno-expressão do TIMP-1, cujo padrão de intensidade e distribuição é elevado e relativamente constante ao longo do período estudado. Do estudo morfológico realizado pode-se constatar que a imunomarcação das da MMP-1, da MMP-9 e do TIMP-1 é uma constante tanto no componente epitelial endodérmico, como no componente mesenquimatoso do pulmão. Mercê da influência da vitamina A na expressão da MMP-9, observou-se igualmente uma modificação da proporção relativa entre a MMP-9 e o TIMP-1. Como tal, no início do período canalicular (16º dia de gestação) há, no pulmão de fetos provenientes de mães às quais foi administrada vitamina A, um marcado perfil antiproteolítico em relação à MMP-9, enquanto que no dia anterior ao nascimento se verifica um aumento da proteólise induzida por esta metaloproteinase. Dado que a MMP-9 tem como principal substracto o colagéneo de tipo IV, um dos principais componentes membrana basal, e é igualmente capaz de degradar outros compostos que lhe estão associados, a vitamina A parece promover a remodelação activa da membrana basal, antecipando assim a formação de uma barreira alvéolo-capilar funcional. Os resultados obtidos através da aplicação das metodologias mencionadas nos parágrafos precedentes permitem concluir que a administração criteriosa de vitamina A, em dose adequada e fora do período de teratogenicidade deste composto, modela a morfogénese pulmonar, através da regulação do VEGF, dos receptores a ele associados e do equilíbrio gerado entre as metaloproteinases da matriz e os seus inibidores tecidulares. As vias de sinalização desencadeadas pela ligação do VEGF ao VEGFR-1 e ao VEGFR-2 são múltiplas, intervindo nos processos de regulação autócrina e parácrina subjacentes à morfogénese e ramificação dos componentes epitelial endodérmico e vascular do pulmão, bem como às interacções entre estes e os demais componentes do espaço intersticial. A importância funcional da correcta expressão temporo-espacial dos compostos moleculares avaliados no presente estudo é ainda reforçada pelo facto de estes se apresentarem alterados em situações de imaturidade do pulmão, como é o caso dos prematuros e das vítimas de broncodisplasia pulmonar. Esta doença caracteriza-se não só pela existência de anomalias vasculares, mas também por um bloqueio da alveolização que compromete todo o processo de organogénese pulmonar. Em suma, a acção morfogenética da vitamina A, exercida através do seu metabolito activo, o ácido retinóico, quando administrada durante a gestação, favorece a expressão de factores angiogénicos e, por consequência, acelera todo o processo de desenvolvimento e maturação pulmonar, processo este que parece ser mais precoce nos indivíduos do sexo feminino. São, no entanto, necessários trabalhos adicionais que comprovem a existência de dimorfismo sexual durante a organogénese pulmonar, bem como estudos que aprofundem as diversas vias de transdução de sinal mediadas pela vitamina A durante o desenvolvimento do órgão. Os resultados obtidos neste estudo poderão ainda ser relevantes na futura escolha das terapias a implementar em casos de risco de parto prematuro ou de broncodisplasia pulmonar.
The present thesis is part of a wider set of studies that have been carried out for more than two decades at the Institute of Histology and Embriology of the Faculty of Medicine of the University of Coimbra on the morphogenesis, histogenesis and histophysiology of the lung. It aims at contributing to a better knowledge of the effects of vitamin A on some of the more important regulators of lung vascular development. Using laboratory mice, Mus musculus, strain ICR (CD-1®) as an experimental model, we followed the lung’s development from the 15th gestational day till the day of birth. This research project comprised the morphological study of VEGF, its receptors (VEGFR), Tie-2, MMP-1, MMP-9, and TIMP-1 in the lung of foetuses and neonates after prenatal administration of vitamin A. The quantification of VEGF and Tie-2 pulmonary levels as well as VEGF plasma levels was performed, and the genetic expression of VEGFR-1 and VEGFR-2 was also accessed. Since the adult lung presents sexual dimorphism, it was deemed appropriate to analyse the results according to sex. In order to place the whole experimental work within a well-defined frame, and after presenting the main scopes of this study, the present thesis was divided into six chapters. Chapter I includes a brief critical review regarding the embryogenesis and morphogenesis of the lung containing the most relevant aspects of vascular development. Chapter II gives special emphasis to the molecular organisation and morphofunctional structure of the molecules under investigation. The goals of this study are discussed from the 3rd to the 6th chapters. Chapter III is dedicated to the morphological and quantitative study of VEGF in lungs and plasma from foetuses and neonates whose mothers were subjected to subcutaneous administration of vitamin A on the 12th gestational day (45 000 UI, 150 µl). Samples were collected daily from the 15th gestational day till the day of birth. VEGF plasma levels were also quantified. Control animals from pregnant mice that received an equivalent volume of placebo at the same gestational day were also studied. The morphological and semi-quantitative study of lung VEGF during the different stages of lung development was performed by immunohistochemistry. Pulmonary and plasma VEGF levels were quantified by ELISA. Both methods revealed that at gestational day 15, VEGF expression in the lung of control foetuses is higher than the one observed in vitamin-A-treated foetuses. Lungs from control foetuses display a strong immunostaining for VEGF that can be observed in the cytoplasm of mesenchymal cells, epithelial cells of the tubular respiratory tree and in the extracellular matrix. However, VEGF plasma levels were higher in foetuses whose mothers had received vitamin A. In the canalicular stage, 16th gestational day, and in the remaining stages of lung development, a progressive increase of VEGF pulmonary levels and a decrease of VEGF plasma levels is observed in mice whose mothers had received vitamin A. On the opposite, VEGF pulmonary levels suffer variations and VEGF plasma levels show a gradual and sustained increase throughout development in control mice. At the day of birth, VEGF pulmonary levels and immunoexpression patterns in control and vitamin A treated neonates are similar. It is important to point out that VEGF pulmonary levels are higher in females from the control group especially on the day before birth. These results show that maternal vitamin A administration influences foetal and neonate VEGF pulmonary and plasma levels, and that vitamin A seems to work in a synergetic manner with VEGF through their morphogenetic effects to enhance lung development. This process will occur earlier in females. Chapter IV handles with the study of Tie-2 immunoexpression and quantification in the lung. Tie-2 is one of the major regulators of vascular remodelling and stabilization, and its presence in the lung of control and vitamin-A-treated animals was evaluated by immunohistochemistry and ELISA. Tie-2’s immunostaining is similar throughout the time span of this study, and can be observed in the cytoplasmic membrane and cytoplasm of interstitial mesenchymal and endothelial cells, as well as in the muscle cells of the vascular walls of both groups under investigation. Tie-2 pulmonary levels reach a peak at the end of the pseudoglandular stage, 15th gestational day, in control foetuses. From this day onwards, Tie-2 levels in the lungs from control and vitamin-A-treated animals suffer a significant decrease and remain constant until the day of birth. As demonstrated for VEGF, Tie-2 pulmonary levels are also higher in female control foetuses at the 18th gestational day. From these results it is possible to conclude that the vitamin A, in the dose applied, does not alter Tie-2 pulmonary expression. Furthermore, the combined results from VEGF and Tie-e pulmonary levels suggest that in female foetuses the angiogenic process is favoured in the day before birth. The study presented in chapter V is devoted to the morphological analysis of VEGFR-1 and VEGFR-2 distribution patterns by immunohistochemistry, and their genetic expression assessment by quantitative RT-PCR. The mRNA levels of both receptors are in accordance with the semiquantitative results of the immunostaining scores. VEFGR-1 mRNA was much lower than VEFGR-2 mRNA and hence, in the early stages of lung development, particularly during the pseudoglandular and canalicular stages, VEGFR-1 immunoexpression is absent in the majority of foetuses. In the remaining periods, endothelial cells, muscle cells of the vascular walls, and some epithelial cells lining the tubular structures of the lung, display VEGFR-1 and VEGFR-2 immunostaining. Type II and I pneumocytes already differentiated at the saccular stage also exhibit immunorreactivity for both VEGF receptors. The morphological study also showed that, in accordance with VEGFR cellular location, immunostaining was predominant at the cytoplasmic membrane. VEGFR-1 and VEGFR-1 mRNA, as well as their imunoexpression in the lungs from vitamin-A -treated foetuses increase gradually throughout gestation and until the day of birth. There is also a trend toward higher values of relative VEGFR-1 mRNA in female foetuses and neonates. Chapter VI deals with the morphological study of the ontogeny of MMP-1 and MMP-9, as well as their tissue inhibitor TIMP-1, during the different stages of lung development in control and vitamin-A-treated foetuses and neonates. The study was carried out by immunohistochemistry. Although MMP-1 and MMP-9 immunoexpression patterns are different during the stages of lung development under study, prenatal administration of vitamin A modified only MMP-9 immunorreactivity. On the contrary, the observations revealed that TIMP-1 expression is high during all stages of foetal lung development and also in neonates. Because of its influence upon MMP-9 lung’s immunoexpression, vitamin A also induced an unbalance of the MMP-9/TIMP-1 ratio. As such, a marked anti-proteolytic profile at the 16th gestational day, and a proteolytic profile at the last gestational day, are displayed in the lungs of vitamin-A-treated foetuses. Since MMP-9 is the main cause of the proteolytic degradation of extracellular matrix components in the basement membrane, namely type IV collagen, the maternal administration of vitamin A seems to promote the active remodelling of this structure, and therefore may anticipate the establishment of a functional blood-air barrier. Taken together, the results provided by the morphological, biochemical, and RT-PCR studies indicate that a criterious administration of vitamin A – in a well-defined dose and once the critical period of retinoid-induced teratogenesis is over – modulates lung morphogenesis through the regulation of VEGF, VEGFR, MMP and TIMP expression. The signalling pathways mediated by VEGF and its receptors, VEGFR-1 and VEGFR-2, are involved in the autocrine and paracrine regulation of lung branching morphogenesis and angiogenesis. The functional relevance of the correct temporal and spatial expression of the molecules investigated in the present study is further reinforced by the fact that their expression changes under medical conditions in which lung immaturity is a common feature, such as premature birth or bronchopulmonary dysplasia. The latter is characterized by vascular abnormalities and disrupted alveolisation, which compromise the whole lung maturation process. In short, the morphogenetic effects of vitamin A and its active metabolite In short, the morphogenetic effects of vitamin A and its active metabolite.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
URI: http://hdl.handle.net/10348/115
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:OLD - Teses de Doutoramento

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