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Título: Canine mammary tumours: new insights into prognosis and molecular classification
Autor: Quaresma, Adelina Maria Gaspar Gama
Orientador: Schmitt, Fernando Carlos de Lander
Alves, Anabela Gouveia Antunes
Palavras-chave: Anatomia patológica veterinária
Neoplasias mamárias
Cadela
Data: 2008
Resumo: Na espécie canina, os tumores mamários espontâneos representam a segunda neoplasia mais comum, sendo apenas ultrapassados pelos tumores de pele. Considerando os indivíduos do sexo feminino, os tumores de mama constituem a neoplasia espontânea mais frequente, representando os tumores malignos cerca de 50% dos casos observados. Estes factos suscitam um interesse crescente na pesquisa de factores de prognóstico credíveis na área dos tumores mamários caninos e à semelhança do que ocorre em Medicina Humana, o patologista veterinário pode assumir um papel fundamental ao fornecer não apenas um diagnóstico histológico, como também informação adicional acerca do prognóstico de um determinado indivíduo. Actualmente, e apesar de vários estudos de prognóstico nesta área, os resultados não são consensuais pelo que se torna necessária a validação dos parâmetros clínico-patológicos considerados clássicos e a pesquisa de novos factores com valor prognóstico. Assim, tendo como objectivo central a pesquisa de factores com possível impacto no prognóstico dos tumores de mama de cadela, procedemos ao estudo de diversas características clínico-patológicas e moleculares, que se encontram discriminadas ao longo deste trabalho. A presente dissertação é constituída por sete capítulos: um capítulo inicial de revisão bibliográfica (Capítulo I); os Capítulos II a VI, que correspondem aos artigos científicos resultantes da investigação desenvolvida; e o Capítulo VII, onde se promove uma discussão geral do trabalho efectuado. O Capítulo I (Introdução Geral) consiste numa revisão bibliográfica actualizada acerca dos tumores de mama de cadela, em especial no que diz respeito a estudos de prognóstico. É ainda dado ênfase particular a alguns marcadores moleculares utilizados ao longo do nosso trabalho, tendo em consideração estudos efectuados em tumores mamários caninos e humanos. No fim deste capítulo, são enumerados os objectivos da presente dissertação. Ao longo do Capítulo II (Tumores mamários caninos: parâmetros clínico-patológicos como factores preditivos da sobrevivência total e sobrevivência livre de doença –análise uni- e multivariada) procedeu-se à caracterização clínica e histopatológica de uma série de 156 tumores de mama de cadela (46 benignos e 110 malignos). Com o objectivo de investigar o valor prognóstico de variáveis clínico-patológicas, foi efectuado um estudo de sobrevivência após exérese cirúrgica em 69 animais, durante um período mínimo de 12 meses. A análise univariada revelou que o tamanho do tumor, o tipo histológico, o modo de crescimento, o grau histológico, a invasão estromal e linfo-vascular, a presença de metástases ganglionares, e os índices de proliferação se encontravam significativamente associados com as sobrevivências total e livre de doença. A presença de ulceração cutânea encontrou-se associada apenas com a sobrevida total. A análise multivariada revelou a presença de metástases ganglionares como o único factor de prognóstico independente. No Capítulo III (Expressão da caderina E, caderina P e β-catenina em tumores mamários caninos malignos em relação a parâmetros clínico-patológicos, proliferação e sobrevivência) efectuou-se a avaliação imunohistoquímica de moléculas de adesão numa série de 65 tumores mamários malignos de cadela. Tendo em conta vários estudos que demonstram a função importante da adesão mediada por caderinas durante os processos de desenvolvimento e na manutenção da arquitectura dos tecidos adultos, bem como o seu envolvimento durante a invasão e progressão tumoral, investigámos a expressão das moléculas acima descritas em tumores mamários malignos de cadela e a sua possível associação com parâmetros clínico-patológicos clássicos, índices de proliferação e sobrevivência. Observámos que a redução da expressão da caderina E esteve significativamente associada com o tamanho do tumor, alto grau histológico, invasão, presença de metástases ganglionares e elevado índice mitótico; por outro lado, a redução da expressão da β-catenina encontrou-se significativamente associada com alto grau histológico e invasão. Relativamente à caderina P, a sua expressão encontrou-se significativamente associada apenas com a invasão. No que diz respeito ao estudo de sobrevivência, a redução da caderina E e β-catenina encontrou-se significativamente associada com menor tempo de sobrevivência total e livre de doença. Apesar deste estudo ter sido efectuado com um número reduzido de amostras, observou-se que a expressão alterada do complexo caderina-catenina é um evento comum nestas neoplasias. A realização de novos estudos com maior número de casos irá certamente esclarecer o valor prognóstico destas moléculas no contexto dos tumores mamários caninos. No Capítulo IV (Expressão imunohistoquímica do Receptor para o Factor de Crescimento Epidérmico (EGFR) em tecidos mamários caninos), descreveu-se a avaliação do EGFR através da técnica de imunohistoquímica numa série de 136 tumores mamários caninos (46 benignos e 90 malignos). Avaliou-se ainda a sua expressão na glândula mamária normal e hiperplásica adjacente. Apesar da existência de vários trabalhos em tumores mamários caninos com recurso a métodos imunoenzimáticos para a avaliação do EGFR, não existem ainda estudos de imunohistoquímica, pelo que considerámos importante avaliar a sua expressão em tumores benignos e malignos, nomeadamente a sua localização celular, informação que não é disponibilizada recorrendo às metodologias previamente descritas na literatura. Na glândula mamária canina normal e hiperplásica, a expressão do EGFR foi observada principalmente ao nível das células mioepiteliais. No entanto, detectou-se positividade para este receptor em algumas células epiteliais luminais ductais, assim como no estroma perilobular. Relativamente aos tumores benignos, o EGFR foi observado no componente epitelial e mioepitelial, apresentando as células epiteliais um nível de expressão reduzido, quando comparado com os tumores malignos. De facto, a expressão de EGFR encontrou-se significativamente associada com a malignidade tumoral, tendo sido detectada uma imunoexpressão membranar completa de EGFR em mais de 10% das células neoplásicas em 42.2% de tumores malignos, versus 19.6% tumores benignos. Não se observou qualquer associação entre a expressão neoplásica do EGFR e os parâmetros clínico-patológicos, à excepção da idade e do tamanho do tumor. Apesar da sobre-expressão do EGFR mostrar uma tendência para um pior prognóstico, não foram encontradas associações estatisticamente significativas neste estudo. Acreditamos serem necessários estudos futuros acerca deste receptor, nomeadamente analisando a presença de amplificação do gene EGFR, já que este receptor pode constituir um potencial alvo terapêutico. No Capítulo V (Expressão e valor prognóstico da citoqueratina (CK) 19 em tumores mamários malignos da cadela) procedeu-se à avaliação imunohistoquímica da CK19 numa série de 102 tumores mamários malignos de cadela, analisando-se a possível associação entre o seu padrão de expressão e parâmetros clínico-patológicos, proliferação e tempos de sobrevivência. À luz de estudos recentes em carcinomas humanos que demonstram uma associação entre a redução da expressão de CK luminais e uma maior agressividade biológica, julgámos pertinente investigar o padrão de expressão da CK19 (CK luminal) nos tumores mamários malignos da cadela,nomeadamente o seu potencial valor prognóstico e também a sua possível associação a um fenótipo basal/mioepitelial, para tal utilizando marcadores específicos de diferenciação celular Neste trabalho, observámos que a redução ou ausência da CK19 se encontrou significativamente associada com o tipo histológico, invasão, alto grau histológico e índice Ki-67 elevado. A expressão da CK19 encontrou-se significativamente associada com a presença de receptores de estrogénio (ER), enquanto a sua redução se revelou associada com a presença de marcadores basais/mioepiteliais. Relativamente ao estudo de sobrevivência, a redução ou ausência da expressão deste marcador luminal provou estar associada a menores tempos de sobrevivência; no entanto, a CK19 não foi considerada como factor de prognóstico independente em análise multivariada. Apesar de, neste estudo, a ausência ou redução da expressão da CK19 se encontrar associada a um fenótipo tumoral mais agressivo, o significado biológico deste achado relativamente à progressão neoplásica permanece por esclarecer. O Capítulo VI (Identificação de fenótipos moleculares em carcinomas mamários caninos com implicação clínica: aplicação de uma classificação humana) reflecte a tentativa de aplicação de uma classificação recentemente descrita para os carcinomas mamários humanos a uma série de 102 carcinomas mamários caninos. Esta classificação teve como base estudos de expressão genética e foi posteriormente comprovada através da técnica de imunohistoquímica, distinguindo diferentes fenótipos moleculares de cancro de mama humano. Recorrendo a marcadores válidos em Medicina Humana para a sua identificação (ER, HER-2, CK5, p63 and caderina P), classificámos os carcinomas mamários caninos em 4 subtipos principais: luminal A (ER+, HER-2-), luminal B (ER+, HER-2+), basal (ER-, HER-2- e um marcador basal positivo) e HER-2 (ER-, HER-2+). À semelhança da mulher, os tumores classificados como luminal A apresentaram baixo grau histológico e menores índices de proliferação, enquanto os carcinomas “basais” se caracterizaram geralmente por alto grau histológico e elevados índices de proliferação. Quanto à sobrevivência, também nos carcinomas de mama de cadela observámos uma associação entre o fenótipo basal e tempos de sobrevivência menores. Estes resultados parecem apontar para a existência de fenótipos moleculares semelhantes aos descritos em Medicina Humana, sugerindo o carcinoma de mama da cadela como um potencial modelo natural de estudo para o carcinoma de mama da mulher. No Capítulo VII (Discussão geral e conclusões) procede-se à discussão global do trabalho desenvolvido, evidenciando-se os seus aspectos mais relevantes.
In canine species, spontaneous mammary tumours constitute the second most frequent neoplasia, surpassed only by skin tumours. When considering female dogs, mammary tumours represent the most common neoplasia, with malignant tumours accounting for up to 50% of cases. These facts have raised an increasing interest on the research of reliable prognostic factors in canine mammary tumours, and similarly to humans, the veterinary pathologist might assume a fundamental role by providing both histological diagnosis as well as additional information regarding the prognosis of a particular animal. At present, and despite several prognostic studies in this area, results are not consensual, which is mandatory for the validation of classical clinicopathological parameters and the search of novel prognostic factors. Therefore, the central goal of our thesis was the research of clinicopathological and molecular factors with potential impact on the prognosis of canine mammary tumours. The present thesis is composed by seven chapters: an initial chapter (Chapter I) corresponding to the state of the art; Chapters II-VI, which correspond to scientific articles resulting from our investigation; and Chapter VII, which promotes a global and final discussion of the results. Chapter I (General Introduction) is a review of the most recent literature concerning canine mammary tumours, especially with regard to prognostic studies. A particular emphasis is given to several molecular cell markers, in view of both canine and human scientific literature. At the end of this chapter, we have delineated the main goals of the present thesis. In Chapter II (Canine mammary gland tumours: clinical and pathological parameters as predictors of overall and disease-free survival - a univariate and multivariate analysis), we have performed a clinical and histopathological characterization of a hundred and fifty six canine mammary tumour specimens (46 benign and 110 malignant). In order to investigate the prognostic value of clinical and pathological variables, a follow-up study was performed in 69 female dogs for a minimum period of 12 months after surgical procedure. Univariate analysis showed that tumour size, histological type, tumour growth, differentiation grade, stromal and lymphovascular invasion, lymph node status, mitotic and Ki-67 labelling indices were significantly associated with overall and disease-free survival. Skin ulceration was only associated with poorer overall survival rates. Cox regression multivariate analysis revealed lymph node status as the only independent prognostic factor. Chapter III (Expression of E-cadherin, P-cadherin and β-catenin in canine malignant mammary tumours in relation to clinicopathological parameters, proliferation and survival) describes the immunohistochemical evaluation of several adhesion molecules on a series of 65 canine malignant mammary tumours. Given the critical role assigned to cadherin-mediated cell adhesion during embryogenesis and in the maintenance of normal adult tissue architecture, as well as its putative involvement in tumour cell invasion and progression, we sought to investigate their expression in canine malignant mammary tumours and their association with clinicopathological variables, proliferation and survival. Reduction in E-cadherin expression was significantly associated with increased tumour size, high histological and invasion grades, lymph node metastasis and high mitotic index, whereas reduced β-catenin expression was associated with high histological and invasion grades. P-cadherin expression was only associated with invasion. In 39 cases for which follow-up data was available, reduced E-cadherin and β-catenin expression was significantly associated with shorter overall survival and disease-free survival. Although this study has been performed with a relatively small number of cases, we have observed that an abnormal expression of adhesion molecules is a common phenomenon in canine mammary malignant tumours and, therefore, may play a central role in tumour progression. Further studies with a larger series will certainly highlight the prognostic value of these molecules in the context of canine mammary tumours. In Chapter IV (Immunohistochemical expression of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) in canine mammary tissues), an evaluation of EGFR immunohistochemical expression was performed in a series of 136 canine mammary tumours (46 benign and 90 malignant) and representative areas of adjacent normal and hyperplastic mammary tissue. Despite the availability of several biochemical studies of EGFR in canine mammary tumours, there are still no immunohistochemical studies concerning its expression, which directed us to its evaluation both in benign and malignant tumours. Immunohistochemistry has the advantage of disclosing the precise cellular location of a particular protein, which is not possible by using immunoenzymatic methodologies. In normal and hyperplastic canine mammary glands, EGFR expression was consistently observed in myoepithelial cells, with luminal cells usually negative. Perilobular stroma was commonly positive. In benign tumours, EGFR was present in both epithelial cell components, but luminal cells were weakly positive, when compared to malignant tumours. In fact, EGFR overexpression was found in 9 benign (19.6%) and 38 malignant (42.2%) lesions, with EGFR positivity significantly related with malignancy. Besides animal age and tumour size, there were no significant associations between other clinicopathological parameters and EGFR overexpression. On survival analysis, tumours with EGFR overexpression showed a reduced disease-free and overall survival; however, these associations failed to reach statistically significant levels. Further studies are warranted, namely concerning the analysis of EGFR gene amplification, given that EGFR might represent a potential therapeutic target. Chapter V (Expression and prognostic significance of cytokeratin (CK) 19 in canine malignant mammary tumours) describes the immunohistochemical evaluation of CK19 in a series of 102 malignant canine mammary tumours and investigates the possible association between CK19 pattern of expression and clinicopathological parameters, proliferation and survival. This study was based on recent evidence demonstrating a significant association between the reduction of luminal CK (such as CK19) and a more aggressive behaviour of human breast cancer, usually associated with a basal phenotype. Therefore, besides the evaluation of the prognostic potential of this luminal cell marker, we have also investigated its association with a basal/myoepithelial phenotype, by using additional specific cell differentiation markers. Reduced/absent CK19 was significantly associated with histological type, invasiveness, high histological grade and an elevated Ki-67 index. CK19 positive expression was significantly associated with the presence of ER, whereas its reduced immunostaining was associated with basal/myoepithelial cell markers positive expression. Survival analysis demonstrated that down-regulation of this luminal CK is significantly associated with shorter overall and disease-free survival rates; however, CK19 was not an independent prognostic factor in multivariate analysis. In our series, CK19 down regulation was significantly related to an aggressive phenotype; yet, the real implication of this phenomenon is not known, namely during tumour progression. Chapter VI (Identification of molecular phenotypes in canine mammary carcinomas with clinical implications: application of the human classification) illustrates the application of a recently described classification for human breast carcinomas to a series of 102 canine mammary carcinomas. This classification was initially based on gene expression profiling analysis and it was later on reinforced at the protein level, by using immunohistochemistry; both methodologies identified distinct phenotypes of human breast cancer associated with distinct clinical behaviours. Similarly to human studies, by using an immunohistochemistry surrogate panel based on five molecular markers (estrogen receptor, HER-2, cytokeratin 5, p63 and P-cadherin), we were able to classify canine mammary carcinomas into four different subtypes: luminal A (ER+/HER-2-), luminal B (ER+/HER-2+), basal (ER-/HER-2- and a basal marker positive) and HER-2 overexpressing tumours (ER-/HER-2+). Luminal A-type tumours were characterized by lower grade and proliferation rate, whereas basal-type tumours were mostly high grade, high proliferative and positive for CK5, p63 and P-cadherin. In addition, as in humans, basal subtype was significantly associated with shorter disease-free and overall survival rates. Although we consider these findings as preliminary results, which require further validation, this study pointed out to similar phenotypes to the ones described in the human literature. So, canine mammary carcinomas might represent a suitable natural model for the study of human breast carcinomas, in particular to the basal subset, given the putative high percentage of basal carcinomas identified in the dog. The final Chapter (Chapter VII – General discussion and concluding remarks) encloses a global discussion of our investigation, stressing the most relevant and significant findings.
Descrição: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
URI: http://hdl.handle.net/10348/124
Tipo de Documento: Tese de Doutoramento
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