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Title: Contribution to the Study of Copper Toxicity in Gill of Nile Tilapia, Oreochromis niloticus
Authors: Monteiro, Sandra Mariza Veiga
Advisor: Sousa, Mário de
Fernandes, António Fontaínhas
Keywords: Oreochromis niloticus (Tilápia Nilótica)
Ecotoxicologia
Histologia
Issue Date: 2009
Abstract: O cobre é um micronutriente essencial que se encontra naturalmente em águas não poluídas. Contudo, as actividades mineira, agrícola e industrial, bem como a libertação de efluentes municipais, têm provocado a contaminação crescente dos sistemas aquáticos com níveis tóxicos de cobre. Consequentemente, a necessidade de desenvolver métodos expeditos para avaliar o impacto da toxicidade do cobre na qualidade ambiental e, em particular, na população piscícola, tem vindo a aumentar. Neste contexto, o uso de marcadores biológicos ao nível molecular, celular ou tecidual, tem assumido particular importância, como instrumento sensível de detecção precoce dos efeitos tóxicos, bem como na avaliação da qualidade da água. O epitélio branquial pode constituir um modelo adequado para avaliar a toxicidade do cobre na água. Dada a sua ampla área superficial em contacto directo com o meio externo e o facto de ser o principal local de captação de cobre, a brânquia constitui o primeiro órgão alvo para a toxicidade do cobre. Contudo, para avaliar as alterações morfológicas e fisiológicas causadas pela exposição a este metal, torna‐se necessário em primeiro lugar, caracterizar qualitativa e quantitativamente, a estrutura morfológica da brânquia de Oreochromis niloticus, a espécie usada no presente trabalho. Adicionalmente, alguns parâmetros morfológicos, bioquímicos e moleculares foram avaliados após a exposição dos peixes a diferentes concentrações de cobre ao longo de um período de 21 dias. De acordo com os objectivos propostos, no decurso deste estudo é apresentada a descrição ultrastrutural do epitélio branquial de O. niloticus, bem como a caracterização quantitativa dos seus componentes histológicos. Qualitativamente, o epitélio branquial desta espécie, apesar de similar ao de outros teleósteos de água doce, apresentou algumas características particulares. Entre estas, é de realçar a existência, no epitélio filamentar, de duas regiões morfológica e funcionalmente distintas, uma camada superficial e outra localizada em profundidade. No epitélio filamentar superficial foram observados dois tipos distintos de células ricas em mitocôndrias e as respectivas precursoras, células mucosas e um tipo celular menos comum, as células de suporte. O epitélio profundo é caracterizado pela presença de diferentes tipos de células separados por amplos espaços intercelulares. Nesta região, foi possível identificar células indiferenciadas, neuroendócrinas, macrofágicas e ainda células com características comuns aos eosinófilos. No revestimento baso‐lateral foram observadas células mioepiteliais e um ramo ascendente da membrana basal. Por sua vez, o leito capilar das lamelas apresentou‐se rodeado por pericitos. Os resultados histoquímicos revelaram ainda a existência de subpopulações diferentes de células mucosas e de células neuroendócrinas e permitiram a identificação de células granulares eosinófilas na região profunda do epitélio filamentar. A utilização de anticorpos diferentes permitiu a co‐localização das células ricas em mitocôndrias, sugerindo o seu possível envolvimento em funções neuroendócrinas. Adicionalmente, a presença da H+‐ATPase do tipo V em células pavimentosas sugere a sua contribuição no mecanismo de captação de Na+. Quantitativamente, os dados demonstraram que o epitélio filamentar e a lamela constituem os principais componentes, correspondendo a 28 e 39%, respectivamente, do volume do filamento. Por sua vez, o eixo central (16%) e o seio venoso central (14%) apresentaram densidades volumétricas inferiores. Os volumes ocupados pelas células mucosas e pelas células ricas em mitocôndrias foram de 2 e de 1%, respectivamente. Os efeitos ultrastruturais provocados pela exposição a concentrações subletais de cobre (600 μg L‐1) incluem a retracção das células pilar e a perda de pericitos, na base da lamela. Por outro lado, na região lamelar apical, as células pilar permaneceram inalteradas e os pericitos e as células pavimentosas apresentaram alguns sinais de activação, indiciando uma maior resistência à acção tóxica do cobre. Ao nível do epitélio filamentar, observou‐se uma perda nas células colunares superficiais e, na região profunda, detectou‐se proliferação de células indiferenciadas e conversão de células com características leucocitárias em macrófagos activos. Com o aumento do tempo de exposição, detectaram‐se alguns sinais de regeneração e adaptação ao poluente. A exposição a doses letais (1300 μg L‐1) induziu a retracção das células pilar, o desaparecimento de pericitos e o espessamento da membrana basal. As células colunares desapareceram por completo da região superficial do epitélio filamentar, que ficou restrito a uma monocamada de células pavimentosas. Observou‐se ainda a ruptura focal do epitélio filamentar e do eixo vascular das lamelas. Após 3, 7, 14 e 21 dias de exposição a 40 e 400 μg L‐1 de cobre, foi determinada a acumulação do metal no tecido branquial, que revelou aumentar linearmente com o tempo de exposição e a concentração de tóxico. Por sua vez, a actividade da Na+/K+‐ATPase branquial sofreu uma inibição máxima após 3 dias de exposição, apresentando uma correlação negativa com o cobre acumulado. Os níveis plasmáticos de Cl‐, Na+ e de proteínas, bem como a osmolalidade, diminuíram ao longo do tempo de exposição a 400 μg L‐1. Na concentração inferior (40 μg L‐1), este efeito só foi relevante aos 21 dias de exposição. Os níveis plasmáticos de glucose e cortisol aumentaram de forma dependente do tempo e da dose, demonstrando a activação dos eixos hipotá‐lamo‐pituitária‐células inter‐renais e hipotálamo‐sistema nervoso simpático‐células cromafínicas. As respostas compensatórias ao stress, induzidas pela activação destes eixos, contribuíram provavelmente, para a manutenção das desordens nos parâmetros osmorregulatórios, que se continuaram a observar após tempos prolongados de exposição. Na base dos distúrbios osmorregulatórios podem, adicionalmente, ter estado as alterações histopatológicas induzidas pelas mesmas concentrações de cobre (40 e 400 μg L‐1). Entre estas, são de realçar o edema, destacamento epitelial, alterações na espessura do epitélio filamentar, fusão lamelar, vasodilatação e aneurismas. A extensão e severidade de cada uma foram combinadas no desenvolvimento de uma escala de gradação de severidade. A análise semi‐quantitativa demonstrou que determinadas lesões, como o edema e os aneurismas, variam de acordo com a concentração de cobre, após exposição aguda, enquanto outras, como a fusão lamelar, são melhores indicadores após exposição crónica. Por outro lado, o destacamento epitelial e as alterações na espessura do epitélio reflectem adequadamente o tempo de exposição a concentrações de cobre mais baixas (40 μg L‐1) ou mais elevadas (400 μg L‐1), respectivamente. As variações observadas no perfil gradativo de cada lesão, bem como na escala de severidade cumulativa, apresentaram correlações significativas com o cobre acumulado no tecido branquial, validando portanto, os fundamentos do modelo do ligando biótico. A análise estereológica quantitativa demonstrou que a exposição ao cobre induz diferenças estruturais que se reflectem, principalmente, na densidade volumétrica do epitélio filamentar e da lamela, as quais variaram inversamente ao longo do período de exposição. Os resultados sugerem ainda que os níveis mais elevados de cobre (400 μg L‐1) desencadeiam mecanismos crónicos de defesa, enquanto concentrações mais baixas (40 μg L‐1) conduzem a adaptação, numa resposta aguda moderada. A exposição ao cobre provocou um decréscimo no volume relativo das células mucosas, embora a exposição crónica a níveis elevados, sugira uma resposta compensatória, identificada pelo aumento considerável no volume relativo das células mucosas precursoras. A densidade volumétrica das células ricas em mitocôndrias diminuiu após a exposição ao cobre, principalmente devido a um decréscimo na sua densidade numérica. Contudo, a exposição crónica aos níveis mais baixos de cobre estimulou o aumento das células lamelares. Os resultados quantitativos demonstram ainda que a variação no volume relativo das células está dependente de alterações no epitélio filamentar e na lamela, enfatizando a importância de utilizar metodologias estereológicas na análise e comparação de resultados histológicos. Por último, as concentrações de cobre testadas não induziram, durante o período de tempo analisado, um aumento na expressão do gene da caspase‐3 branquial. Também não foram observadas evidências de activação da enzima já existente ou de indução de apoptose por vias independentes de caspases. Em oposição, a densidade volumétrica das células em proliferação no filamento branquial aumentou significativamente. Contudo, o volume relativo do epitélio filamentar não sofreu acréscimos, sugerindo uma perturbação no equilíbrio entre mitose e degeneração celular.
Copper is an essential micronutrient naturally occurring in unpolluted freshwaters. However, as a result of mining, agricultural and industrial activities, as also due to the releasing of municipal effluents, the contamination of aquatic systems with toxic copper levels is growing. Consequently, there is an increasing need to develop methods to expeditiously assess the impact of copper toxicity on environmental quality and, therefore, in fish populations. In this context, the use of biological markers or biomarkers measured at molecular, cellular or tissue level is of great importance as sensitive early warming tools for biological effect measurement in environmental quality assessment. The gill epithelium constitutes a suitable model to evaluate waterborne copper toxicity. It has a large surface area in direct contact with the water, constituting the main site of copper absorption. Accordingly, it is also the first target organ to copper toxicity. However, in order to assess the morphological and physiological changes caused by waterborne exposure to this pollutant it seemed necessary, in the first place, to characterize the normal qualitative and quantitative gill histology and cytology of the cichlid Oreochromis niloticus, the sentinel species used in this work. In addition, some morphological, biochemical and molecular parameters were studied after exposure to different copper concentrations, throughout a 21 days period. In this study, the O. niloticus gill ultrastructure was for the first time described and their histological components qualitatively and quantitatively characterized. The qualitative description revealed that although similar to other freshwater teleosts, the gill epithelia of this species show some particular features with the existence of two morphological and functionally distinct regions: a superficial and a deep layer. In the superficial filament epithelium, there are two distinct types of mitochondria‐rich cells and their respective precursors, mucous cells and the less common support cells. The deep layer is characterized by the presence of several cell types separated by wide intercellular spaces. We were able to identify undifferentiated, neuroendocrine, macrophage and eosinophil‐like cells, as well as their precursors and precursors of mucous cells. The basal‐lateral region is roofed by myoepithelial cells and an ascending branch of the basal lamina. The lamellar capillary bed is surrounded by pericytes. The histochemical data further demonstrated the existence of different subpopulations of mucous and neuroendocrine cells and allowed the identification of giemsa‐positive eosinophil granular cells in the deep filament epithelium. Different antisera co‐localized mitochondria‐rich cells, suggesting their possible involvement in neuroendocrine functions. The presence of V‐type H+‐ATPase in O. niloticus pavement cells demonstrated their contribution to the Na+ uptake mechanism. Quantitatively, filament epithelium and lamellae constitute the major gill filament components, comprising 28 and 39% of the filaments volume, respectively. On the other hand, the central axis (16%) and central venous sinus (14%) revealed inferior volumetric densities. The volumes occupied by mucous and mitochondria‐rich cells were 2 and 1%, respectively. The ultrastructural effects of sublethal copper concentrations (600 μg L‐1) revealed the pillar cells stretching and loss of pericytes in lamellar base, while in the apical region, pillar cells were undamaged and pericytes and pavement cells were activated, showing higher resistance to the copper toxic action. In the filament epithelium, there was loss of superficial columnar cells and, in the deep region, despite the edema and hypotrophy of neuroendocrine cells, there was proliferation of undifferentiated cells and conversion of leukocyte‐like cells into active macrophages. As the exposure time increases, some signs of regeneration and adaptation to the pollutant were evident. Lethal copper doses (1300 μg L‐1) induced pillar cells retraction, the disappearance of pericytes and the thickening of the basement membrane. In addition, there was a completely disappearance of the columnar cells from the superficial region of the filament epithelium, that was restricted to a monolayer of pavement cells. Rupture in filament epithelium and in the lamellar vascular axis was also registered. After exposure to more environmentally realistic copper doses (40 and 400 μg L‐1), during 3, 7, 14 and 21 days, we observed that copper accumulation in gill tissue increased linearly with time and waterborne concentration. On the other hand, gill Na+/K+‐ATPase activity was maximally inhibited soon after 3 days, showing negative correlations with gill copper burden. Plasma levels of Cl‐, Na+, protein and osmolality, decreased along the time of exposure to 400 μg L‐1. At 40 μg L‐1, this effect was only noted after 21 days of exposure. Plasma glucose and cortisol levels increased in a dose and time dependent manner demonstrating the activation of hypothalamus‐pituitary‐ ‐interrenal and hypothalamus‐sympathetic‐chromaffin cells axes thus leading to different compensatory responses. These stress responses probably contributed to the sustained disorders observed in osmoregulatory parameters after long term exposures. In addition to the osmoregulatory disturbances, these copper concentrations (40 and 400 μg L‐1) also induced some gill histopathological changes such as edema, lifting, changes in filament epithelium thickness, lamellar fusion, vasodilatation and aneurisms. The extent and severity of each one were then combined to develop a severity gradation scale. The semi‐quantitative analysis revealed that edema and aneurisms reflected the copper level after acute exposure whereas lamellar fusion is a better indicator upon chronic exposure. Moreover, epithelial lifting and changes in filament epithelium thickness fairly reflect the time of exposure to low and high copper concentrations, respectively. In addition, we observed that the severity gradation profile of each lesion and the cumulative severity scale depended on gill copper burden, validating the biotic ligand model assumptions. The use of stereological quantification methods showed that, copper exposure induces structural quantitative differences in the volumetric density of filament epithelium and lamellae, which varied inversely along the period of exposure. Data suggested that high toxic copper levels (400 μg L‐1) declanch a chronic defense mechanism while lower metal concentrations (40 μg L‐1) caused an adaptation, within a moderate acute phase‐type of response. Copper exposure also induce a decrease in mucous cells relative volume, and a compensatory response with a marked rise in stem mucous cells, occurring at chronic exposure to high copper levels. The volumetric density of filament mitochondria‐rich cells decreased after copper exposure, while lamellar cells increased after chronic exposure to lower copper levels. The general decrease in mitochondria‐rich cells relative volume was mainly due to a reduction in its numerical density. Data also demonstrate that the variation in cell relative volumes is dependent on the variations in filament epithelium and lamellae, clearly emphasizing the importance of using stereological tools in analysis and comparison of histopathological findings. During the exposure period analyzed, the copper concentrations tested did not induce the upregulation of gill caspase‐3 gene. Additionally, there were no evidences of the activation of the already existing enzyme, or the apoptosis induction through a caspase independent pathway. In opposition, the volumetric density of proliferating cells increased in gill filament. Despite this, the filament epithelium relative volume did not increase, thus suggesting a disruption in the equilibrium between mitosis and cell degeneration.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Biológicas
URI: http://hdl.handle.net/10348/2121
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:OLD - Teses de Doutoramento

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