Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/2125
Título: Estudo de Genes Candidatos na Doença Periodontal em Canis Familiaris: Análise Molecular dos Genes IL6 e LTF
Autor: Morinha, Francisco José Guedes
Orientador: Bastos, Estela
Viegas, Carlos
Palavras-chave: Doenças periodontais
Polimorfismo genético
Cão
Doença da boca
Data: 2010
Resumo: A Doença Periodontal (PD) inclui as doenças inflamatórias induzidas pela placa bacteriana no periodonto. Inicialmente manifesta-se na forma de gengivite, podendo evoluir para uma forma inflamatória crónica designada periodontite. A origem e modulação da PD está associada principalmente a factores microbianos e ambientais, apresentando, contudo, uma etiologia multifactorial onde factores comportamentais, sistémicos e genéticos são descritos. A importância da PD na medicina humana é inequívoca estimando-se que 30% da população adulta seja afectada. Na medicina veterinária, a PD é igualmente muito relevante, sendo a doença mais prevalente e frequente da cavidade oral nos carnívoros domésticos. Adicionalmente, a PD tem sido associada a outras doenças de ordem sistémica, factor que tem contribuído para o crescente interesse na investigação dos factores associados ao seu desenvolvimento. Muitos agentes e/ou mediadores envolvidos na PD ainda são pouco claros, sendo necessário desenvolver novos estudos que interrelacionem esses factores/indicadores de risco. A sua identificação precoce poderá auxiliar a traçar perfis de susceptibilidade, permitindo caracterizar os indivíduos com maior predisposição para a doença e desenvolver terapias personalizadas e estratégias preventivas mais eficientes. A investigação molecular e genética tem contribuído para o melhor conhecimento da PD tendo sido evidenciado que muitos genes desempenham um papel fundamental na predisposição e progressão da doença, principalmente através da regulação dos mediadores inflamatórios. O cão é um modelo muito utilizado nas várias áreas da investigação periodontológica, pois a PD neste animal apresenta muitas semelhanças com a doença no homem a nível da etiologia e da fisiopatologia, no entanto a sua valência para o estudo dos factores genéticos nunca foi analisada. Com este estudo pretende-se contribuir para a caracterização da base genética da PD no cão e adicionalmente para a sua implementação como modelo no estudo da doença humana. Com esse objectivo foram seleccionados dois genes (IL6 e LTF) potencialmente associados à susceptibilidade para a PD no homem. Variações no gene IL6 parecem influenciar a resposta inflamatória desta citocina contra agentes infecciosos e influenciar a reabsorção óssea associada à PD. Alterações no gene LTF são associadas a alterações das funções anti-microbianas desta molécula, influenciado a susceptibilidade para a doença. Neste trabalho efectuou-se uma análise molecular dos genes LTF e IL6 do cão, com o objectivo principal de identificar variações genéticas e analisar a sua associação à PD através de um estudo caso-controlo. Com essa finalidade e tendo em vista a continuidade desta investigação, começou-se por criar uma base de dados onde foi incluída toda informação clínica e material biológico (sangue e tecido gengival) dos animais analisados neste estudo. Neste trabalho foram analisadas três regiões do gene LTF e duas do gene IL6, seleccionando-se primers específicos para a sua amplificação por PCR utilizando o DNA extraído com sucesso a partir dos elementos figurados do sangue. Todos os fragmentos amplificados foram sequenciados, permitindo a identificadas de oito variações genéticas no gene LTF e três no gene IL6. As frequências de todas estas variações foram analisadas num estudo do tipo caso-controlo englobando uma população de 70 animais, divididos num grupo controlo (45) e num grupo de casos com PD (25), de forma a avaliar a sua influência na susceptibilidade para a doença. Foi ainda realizada a optimização de uma metodologia para a extracção de RNA a partir de tecido gengival. Estas amostras foram utilizadas posteriormente na optimização das condições de amplificação por RT-PCR do cDNA do gene IL6, tendo em vista a realização de futuros estudos de expressão envolvendo este gene. Os resultados mostraram que para todas as variações genéticas identificadas não existiram diferenças estatisticamente significativas entre o grupo controlo e o grupo de casos com PD, não permitindo relacionar qualquer variação com a susceptibilidade para a PD no cão. No entanto, todas estas variações foram descritas pela primeira vez, tendo sido observadas diferenças interessantes quando as sequências foram comparadas com os dados disponíveis nas bases de dados genómicas do NCBI e Ensembl. É importante desenvolver novos estudos para esclarecer o papel das variações genéticas identificadas neste trabalho, envolvendo populações de maior dimensão. Este é o primeiro estudo direccionado para a caracterização genética da PD do cão, sendo importante prosseguir a investigação no sentido de analisar outros genes candidatos, variações genéticas e a forma como podem influenciar a susceptibilidade para a doença, de forma a contrapor resultados e avaliar a aplicabilidade deste modelo para o estudo da PD humana.
Periodontal Disease (PD) includes inflammatory diseases induced by bacterial plaque in the periodontium. Initially it is manifested in the form of gingivitis and can progress to a chronic inflammatory form called periodontitis. The origin and modulation of PD is mainly associated to microbial and environmental factors; however it presents a multifactorial etiology, in which behavioral factors, systemic and genetic factors are described. The importance of PD in human medicine is clear and it is estimated that 30% of the adult population is affected. In veterinary medicine, DP is also very important, being the most common disease of the oral cavity in domestic carnivores. Furthermore, the PD has been associated with other systemic diseases, a factor that has contributed to the increasing interest in the investigation of factors related to its development. Many agents and/or mediators involved in PD remain unclear, being necessary to develop new strategies to analyse them. Its early identification may help to establish profiles of susceptibility, allowing the characterization of individuals with a higher predisposition to the disease and develop personalized therapies and more efficient preventive strategies. The molecular and genetic research has contributed to a better understanding of PD and has shown that many genes play a role in the predisposition and progression of disease, primarily through the regulation of inflammatory mediators. The dog is a model classically used in many areas of periodontology, because in this model the PD has many similarities to the disease in man in terms of pathophysiology and etiology, however its valence for the study of genetic factors has never been analyzed. This study aims to contribute to the characterization of the genetic basis of PD in the dog and its implementation as a model in the study of human disease. With this objective we selected two genes (IL6 and LTF) potentially associated with susceptibility to PD in humans. Changes in IL6 gene appear to influence this inflammatory cytokine responses against infectious agents and influence bone resorption related to PD. Variations in the LTF gene are associated with changes in anti-microbial functions of this molecule, influencing the susceptibility to the disease. This work carried out a molecular analysis of LTF and IL6 genes in dog, to identify genetic variations and verify its association with PD in a case-control study. To this end and in order to continue this investigation, we first organized a database that included clinical information and biological materials (blood and gingival tissue) of the animals analyzed in this study. We analysed three regions of the LTF gene and two regions of the IL6 gene and selected specific primers for their amplification by PCR using DNA extracted successfully from figurative elements of the blood. All amplified fragments were sequenced, allowing the identification of eight genetic variations in the LTF gene and three in IL6 gene. The frequencies of all variations were analyzed in a case-control study comprising a population of 70 animals, divided into a control group (45) and a group of cases with PD (25), to assess their influence on susceptibility to disease. In addition we optimized a method for extracting RNA from gingival tissue. These samples were used in the optimization of the amplification by RT-PCR of cDNA of IL6 gene in order to carry out future studies involving gene expression. For all the genetic variations identified, the results showed that there were no statistically significant differences between the control group and the group of cases with PD, unable to correlate any variation with susceptibility to PD in dogs. However, all these changes were first described in this work and interesting differences were observed, when our sequences were compared with the sequence data available in genomic databases of NCBI and Ensembl. It is important to develop future studies to clarify the role of the genetic variations identified in this work, involving larger populations. This is the first study focussed to the genetic characterization of the DP in dog. It is essential to continue this research to determine others candidate genes, genetic variations and how they can influence susceptibility to disease, in order to compare the results and analyse the applicability of this model in the human PD research.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/2125
Tipo de Documento: Dissertação de Mestrado
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