Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/2126
Title: Transthyretin as an enhancer of nerve regeneration: disclosing mechanism and biological consequences
Authors: Leite, Sérgio Ricardo Pais Carvalho
Advisor: Sousa, Mónica Luísa Ribeiro Mendes de
Keywords: Sistema nervoso
Regeneração nervosa
Issue Date: 2010
Abstract: A Transtirretina (TTR) é uma proteína homotretamérica sintetizada no fígado e plexo coróide do cérebro, sendo mais conhecida pela sua actividade como transportadora plasmática da tiroxina (T4) e do retinol. A TTR é também reconhecida por causar, quando mutada, a polineuropatia amilóide familiar (PAF), uma doença neurodegenerativa caracterizada pela deposição extracelular de agregados e fibrilhas de TTR, particularmente no sistema nervoso periférico (SNP). Apesar da sua actividade como proteína transportadora e da sua presença na PAF serem as características mais conhecidas, novas funções da TTR têm sido descritas. Das suas novas funções destacam-se a de protease e de proteína promotora da regeneração nervosa. Apesar da descoberta da actividade proteolítica da TTR, o seu mecanismo de acção permaneceu pouco conhecido. Recentemente, dados estruturais da TTR complexada com zinco e a inibição da sua actividade proteolítica por inibidores de metaloproteases (quelantes de metais) levantaram a hipótese da TTR ser uma metaloprotease. Neste trabalho demonstrámos essa hipótese e identificámos a tríade catalítica composta pelos resíduos His88, His90 e Glu92. As mutações de cada um dos resíduos demonstraram que a tríade é responsável pela actividade proteolítica e que o resíduo Glu72 actua como base geral do mecanismo de proteólise. A função da TTR no nervo periférico foi investigada. A TTR é conhecida por ser promotora da regeneração nervosa e a sua ausência em murganhos TTR knockout (KO) causa uma deficiência sensorial e motora que se torna progressivamente mais severa com o envelhecimento. As causas da deficiência permanecem desconhecidas. Neste trabalho foi avaliado o nervo ciático, nomeadamente a densidade de fibras mielinizadas e alterações patológicas da mielina (como tomaculas e infoldigs), bem como as junções neuromusculares em murganhos wild type (WT) e TTR KO com 24 meses de idade. No entanto, não foram encontradas diferenças em nenhum dos parâmetros avaliados. A análise de microarrays revelou funções específicas da TTR relacionadas com o transporte, neurogénese e transmissão do impulso nervoso, bem como em componentes celulares como a sinapse, citoesqueleto e projecção celular. Contudo a validação por PCR quantitativo dos microarrays demonstrou que a expressão diferencial está apenas presente em 50% dos genes. Foi também avaliada uma putativa função da TTR no sistema nervoso central (SNC). Verificou-se que em culturas in vitro de neurónios corticais de embriões com 15.5 dias, os neurónios TTR KO apresentam um aumento de 30% no crescimento das neurites, quando comparados com embriões WT. Isto sugere que a TTR poderá ter uma função no controlo do crescimento axonal em neurónios do SNC. Concluindo, neste projecto é descrito o mecanismo proteolítico da TTR, uma das suas funções biológicas com potenciais implicações terapêuticas. Por outro lado, a função da TTR na biologia do nervo e no envelhecimento é ainda pouco clara, assim como a sua possível função no SNC.
Transthyretin (TTR) is a homotetrameric protein synthesized in the liver and in choroid plexus of brain and mostly known for its activity as a plasma transporter of thyroxine (T4) and retinol. TTR is also widely known to cause, when mutated, familial amyloid polyneuropathy (FAP), a neurodegenerative disease characterized by the extracellular deposition of TTR aggregates and fibrils, particularly in the peripheral nervous system (PNS). Although the activity as a transporter and the role in FAP are the best acknowledged, new TTR functions have been discovered, namely its function as a protease and its role as an enhancer of nerve regeneration. Despite the finding that TTR has proteolytic activity, its mechanism of action remained unclear. Recently, evidences from structural data of TTR complexed with zinc and inhibition of proteolytic activity with metalloprotease inhibitors (metal chelators) raised the hypothesis of TTR being a metalloprotease. In this work we demonstrate this hypothesis and identified a catalytic center formed by His88, His90 and Glu92. Our experiments mutating each of these residues concluded that this triad is responsible for the proteolytic action, and that Glu72 is the residue that acts as a general base. The role of TTR in the peripheral nerve was also assessed. TTR is known to be an enhancer of nerve regeneration and in its absence TTR knockout (KO) mice develop a sensory and motor impairment that progress with age. The exact reasons for this phenotype remained undisclosed. We evaluated the sciatic nerve, namely the density myelinated fibers and axonopathic changes (tomacula and myelin infoldings), as well as the neuromuscular junctions (NJMs) from 24 months-old wild type (WT) and TTR KO mice; no differences that could underlie the sensorimotor impairment were found between strains. Microarray data from normal sciatic nerves of WT and TTR KO mice was also analyzed and validated. The analysis of the microarray data suggested that TTR has specific functions in the transport, neurogenesis or transmission of nerve impulse and impacts in cell components such as the synapse, cytoskeleton or cell projection. However, validation of the microarray showed that the differential expression was only present 50% of the genes, assessed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). A putative role of TTR in central nervous system (CNS) axonal growth was also assessed. The results obtained suggest that TTR may have a role in axonal growth of CNS neurons, as cortical neurons from E15.5 TTR KO embryos in culture presented a 30% increase in neurite outgrowth (total neurite length and length of the longest neurite) when compared to WT controls. In conclusion, in this work we have described the TTR proteolytic mechanism, an aspect of TTR biology with promising therapeutically implications. In the other hand, the role of TTR in nerve physiology and aging is still undisclosed, as well as a putative role of TTR in the CNS.
Description: Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
URI: http://hdl.handle.net/10348/2126
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:OLD - Dissertações de Mestrado

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