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Title: Osteogenic Potential of Human Wharton’s Jelly Stromal Cells Cultured on Hierarchical Fibrous-Based Scaffold
Authors: Gouveia, Analuce Canha
Advisor: Neves, Nuno Meleiro
Carnide, Olinda da Conceição Pinto
Issue Date: 2010
Abstract: A Engenharia de Tecidos é um novo conceito que surgiu como uma estratégia alternativa às terapias actuais aplicadas nas desordens musculoesqueléticas. Esta estratégia difere da transplantação de órgãos pela regeneração do tecido do próprio paciente, evitando assim a rejeição imunológica e a fraca biocompatibilidade. Na estratégia de engenharia de tecidos desenvolvida pelo Grupo de Investigação 3Bs, o scaffold desempenha um papel crítico. A arquitectura do scaffold é uma característica importante pois permite modular a resposta biológica ao respectivo scaffold. Apesar da completa interconectividade que caracteriza os scaffolds produzidos por prototipagem rápida (RP), a baixa eficiência de seeding continua a ser uma limitação para aplicações de engenharia de tecidos. Uma solução possivel para esta limitação é a integração de nanofibras nas estruturas de prototipagem. Os scaffolds hierarquicos (6 RP+ 5NFM) são obtidos pela combinação de microfibras e nanofibras, produzidas respectivamente por prototipagem rápida e electrospinning. Este estudo demonstrou que estes scaffold à base de SPCL são favoráveis para as estratégias de engenharia de tecidos. As imagens de Microscopia Eletrónica de Varrimento e Hematoxilina-Eosina provam que a integração das nanofibras nos scaffold RP melhora a eficiência de seeding. Estas imagens também demonstraram que hWJSCs aderiram preferencialmente às malhas de nanofibras. Além disso, as células foram capazes de se multiplicar e colonizar as regiões internas dos scaffolds. Este facto indica que a porosidade e interconectividade dos scaffolds produzidos são suficientes para a infiltração de células. A quantificação de DNA e os ensaios de viabilidade (MTS) também corroboram a hipótese destes scaffolds serem uma válida alternativa aos scaffolds de prototipagem rápida. O potencial osteogénico das construções celulares formadas pelos scaffolds 6 RP+NFM e hWJSCs foi comprovado pelos níveis mais elevados de ALP, o que indica uma diferenciação precoce das hWJSCs. No espectro de EDS é possivel detectar a presença de iões cálcio e fósforo o que confirma a minerilização destas construções celulares. A diferenciação osteogénica também foi confirmada pela análise de PCR em Tempo Real. Após 3 semanas de cultura, é possivel a detecção de sobreexpressão de genes associados à diferenciação osteogénica tais como RUNX2, SP7, BGLAP, SPP1 e IBSP. Finalmente, dadas às inúmeras vantagens das hWJSCs e o potencial osteogénico das mesmas quando colocadas em scaffolds 6RP e em scaffolds 6RP+5NFM, esta fonte de células estaminais adultas é uma alternativa promissora para as estratégias de engenharia de tecido ósseo.
Tissue engineering is a new concept emerged as an alternative approach to tissue and organ reconstruction. It differs from organ transplantation by regenerating patient’s own tissue and organs avoiding the biocompatibility and low biofunctionality problems as well as severe immune rejection; which are the main problems of organ transplantation. In tissue engineering approach developed in 3Bs Research Group, the scaffold performs a critical role. The architecture of the tissue engineered scaffold is an important factor to take into consideration that can modulate biological response and the clinical success of the scaffold. Despite the periodical and completely interconnected pore network that characterizes rapid prototyped (RP) scaffolds, cell seeding efficiency still remains a critical factor for optimal tissue engineering applications. Hierarchical fibrous scaffolds, obtained by the combination of RP micro- and electrospun nano-motifs, have been considered a solution to overcome this drawback. This study demonstrated that hierarchical starch-based fibrous scaffolds are favorable for tissue engineering strategies and represent a solution to overcome the cell seeding limitation of rapid prototyped scaffolds. SEM micrographs and HE images prove that the integration of nanofiber meshes into 3D RP scaffolds improved the seeding performance, as they functioned as a cell entrapment system. SEM micrographs demonstrated that hWJSCs adhered preferentially to the nanofiber meshes. Moreover, cells were able to proliferate and colonize the inner regions of the scaffolds, highlighting that the porosity and interconnectivity of the developed scaffolds allow better cell infiltration and ingrowth than the traditional RP scaffolds. Our hypothesis that integration of nanofiber meshes enhances the cell seeding efficiency and provides a better environment for cell growth is also corroborated by the results of MTS viability assay and DNA quantification. Besides the chondrogenic potential of this scaffolds have already been proved, this work also demonstrates their osteogenic potential. Higher levels of ALP expression in WJSCs RP+NFM constructs were detected the second week, reflecting the cells early osteogenic differentiation stage. Moreover EDS spectra showed the presence of calcium and phosphorous elements at the surface of the cell cultured scaffolds, confirming the mineralization. Ultimately osteogenic differentiation of hWJSCs onto RP and RP+NFM scaffolds was demonstrated by Real Time Quantitative-PCR. After 3 weeks of culture, hWJSCs showed upregulation of genes linked to osteogenic differentiation such as transcription factors RUNX2 and SP7, and the matrix proteins BGLAP, SPP1, IBSP. Furthermore, a significantly higher fold change of these genes was detected on hWJSCs RP+NFM constructs, when compared to hWJSCs RP constructs. Concomitantly, given the numerous advantages of adult stem cells as cell source and their successful osteogenesis in 3D polymeric structures, hWJSCs may be a promising alternative for bone tissue engineering strategies.
Description: Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/2174
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:OLD - Dissertações de Mestrado

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