Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/2864
Título: Zalpha domains of the Z-DNA dependent protein kinase PKZ: from cloning to crystal structure
Autor: Zacarias, Sónia Alexandra dos Santos
Orientador: Athanasiadis, Alekos
Bezerra, Rui
Palavras-chave: Peixe Zebra (Danio rerio)
Proteínas
ADAR1
PKR
PKZ
Z-DNA
Z-RNA
Data: 2012
Resumo: Através de proteínas sensoras a imunidade inata tem a capacidade de estabelecer uma resposta que defende as células dos danos causados por agentes patogénicos invasores. Nesta classe de proteínas ecnontra-se a proteína PKZ - proteína cinase dependente de Z-DNA; recentemente descoberta e ainda pouco estudada. A proteína PKZ tem na sua porção N-terminal dois domínios de ligação ao Z-DNA, designados de Zalpha1 (Zα1) e Zalpha2 (Zα2); na sua porção C-terminal tem um domínio catalítico que apresenta grande homologia com um conjunto de proteínas pertencentes à família cinase do factor eucariótico 2 alpha de iniciação à tradução (eIF2α). Esta família é constituída pelas seguintes proteínas: PKR; HRI; GCN2; PERK. O domínio cinase da proteína PKZ apresenta uma maior similaridade com o domínio cinase da proteína PKR - proteína activada por RNA de cadeia dupla. A proteína PKR é activada por RNA de cadeia dupla (dsRNA) viral e subsequentemente vai fosforilar a subunidade α do factor eIF2, gerando uma dimunuição da síntese proteica e consequentemente inibição da replicação vírica. A proteína PKZ desempenha uma função identica à PKR, contudo a grande diferença é que é activada pela ligação ao Z-DNA invés de dsRNA. Os domínios Zalpha ligam-se especificamente ao DNA e RNA de cadeia dupla quando estes adoptam a conformação com giro à esquerda, Z-DNA e Z-RNA, respectivamente. Até ao momento são conhecidas quatro proteínas que contêm domínios de ligação ao Z-DNA; que fazem parte de uma família designada por proteínas de ligação ao Z-DNA. Esta família é composta pelas seguintes proteínas: adenosina desaminase 1 específica de RNA de cadeia dupla (ADAR1), encontrada em vertebrados, o factor regulado por interferão e dependente de DNA (DAI), apenas encontrado em mamíferos, o factor de virulência de poxvirus E3L e a proteína PKZ, até agora apenas encontrada em peixes. Todas estão envolvidas na via antiviral de imunidade inata, conhecida por resposta de interferão. Os domínios de ligação ao Z-DNA apresentam baixa homologia na sua sequência de amino ácidos, assim sendo a análise do modo de ligação de cada domínio Zα ao Z-DNA é um estudo interessante, pois vai possibilitar compreender o seu mecanismo de acção. Neste trabalho, a actividade de ligação entre domínio Zα1 de peixe-zebra (Danio rerio) ao Z-DNA foi confirmada pela técnica de ensaio de troca de mobilidade eletroforética e por dicroísmo circular. Surpreendentemente, verificamos que o segundo domínio Zalpha de Danio rerio , Zα2, é incapaz de se ligar ao Z-DNA. Realizaram-se estudos de cristalografia de raio-X com o domínio Zα1 em complexo com dsT(CG)6 na conformação de Z-DNA. Obteve-se cristais com duas morfologias distintas. Os dados de cristalografia de raio-X foram recolhidos com uma resolução de 1.8 Ǻ com um Rmerge de 8.3%. A futura análise estrutural do complexo Zα1PKZ - Z-DNA irá revelar o modo de ligação entre o domínio Zα1 de PKZ ao Z-DNA.
Innate immunity uses sensor proteins to detect the presence of pathogens and mount appropriate cellular responses to face the cellular injuries; the Protein Kinase Containing Z-DNA Binding Domains (PKZ) is a sensor protein recently discovered. PKZ has at its N-terminus two Z-DNA binding domains, named Zalpha1 (Zα1) and Zalpha2 (Zα2), and at the C-terminus a conserved catalytic domain of the eukaryotic translation initiation factor 2 alpha (eIF2α) kinase family. The kinase domain of PKZ is more closely related to the kinase domain of double-strand RNA dependent protein kinase (PKR), than to any of the other three known eIF2α kinases, the HRI, GCN2, PERK. PKR is activated by viral dsRNA and subsequently phosphorylates the α subunit of eIF2, which leads to an overall down regulation of protein synthesis in the cell and inhibition of viral replication. The same role is played by the PKZ protein when it is activated by the binding of Z-DNA. Zalpha domains specifically bind double stranded DNA (dsDNA) and dsRNA in the left-handed conformation; know Z-DNA and Z-RNA, respectively. Up to now a total of four proteins containing Zα domains are known, constituting a Z-DNA binding family; they are the dsRNA-specific adenosine deaminase 1 (ADAR1), found in vertebrates, the DNA-dependent Activator of IFN-regulatory Factors (DAI), only found in mammals; the poxvirus virulence factor E3L and as referred the PKZ protein, only found in fish species. All these proteins were found to be involved in the antiviral innate immune pathway known as interferon response. The Z-DNA binding domains show limited sequence homology between them which makes worthy to analyze the binding mode of each Zα domain to Z-DNA in order to understand their mechanism of action. In this study, the Z-DNA binding activity of Zα1 of zebra-fish (Danio rerio) was confirmed using a gel mobility shift assay and circular dichroism. Surprisingly we also show that the second Zalpha domain, Zα2, is incapable to bind Z-DNA. In addition we performed X-ray crystallography studies on the Zα1 in complex with dsT(CG)6 in Z-DNA conformation. We found two different crystals morphologies and X-ray diffraction data were collected up to 1.8 Ǻ resolution with an Rmerge of 8.3%. The future structural analysis of Zα1 - Z-DNA complex will reveal the binding mode of Zα1 of PKZ to Z-DNA.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica e Laboratorial
URI: http://hdl.handle.net/10348/2864
Tipo de Documento: Dissertação de Mestrado
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