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Title: Contribution to the study of spinal cord injury: Kinematic model of the hindlimb in the rat: the effects of rolipram administration following spinal cord contusion in the rat
Authors: Costa, Luís Miguel Viana Maltez da
Advisor: Varejão, Artur Severo Proença
Gonzalo-Orden, José Manuel
Keywords: Rato
Traumatismos da medula espinhal
Locomoção
Análise de dados
Fenómenos biomecânicos
Cinemática
Rolipram
Issue Date: 15-May-2014
Abstract: A lesão da medula espinhal é uma condição extramente grave que acarreta elevados custos socioeconómicos devido às limitações físicas e stresse psicológico que lhe estão associados. Apesar de décadas de investigação e ensaios clínicos, a recuperação funcional em pessoas que sofrem de lesão aguda ou crónica da medula espinhal é ainda muito limitada. A lesão secundária que sucede ao dano inicial na medula espinhal origina localmente uma resposta regenerativa espontânea limitada, mas é também responsável por eventos moleculares e celulares que originam um ambiente inibitório para a regeneração axonal. Os fatores inibitórios associados à mielina que se acumulam no local da lesão, exercem várias ações que contribuem para a incapacidade regenerativa dos axónios maduros da medula espinhal. Estes componentes são responsáveis pelo desencadear de uma cascata de processos intracelulares que resulta na contração dos filamentos de actina e miosina no cone de crescimento levando ao seu colapso. Vários estudos demonstraram que o aumento dos níveis de adenosina monofostato cíclico (cAMP) pode reduzir este efeito inibitório e reforçar a capacidade dos neurónios da medula espinhal de regenerar para além da lesão. Nestes estudos, a elevação do cAMP produziu-se pela administração de seus análogos ou indiretamente pela inibição de enzimas responsáveis pela sua degradação, levando à sua acumulação intracelular. Nesta tese estudamos o efeito da administração contínua de rolipram, um inibidor da fosfodiesterase 4, na recuperação funcional e na preservação da substância branca da medula espinhal após a sua lesão experimental. Este agente foi administrado isoladamente durante duas semanas após lesão contusiva moderada da medula espinhal torácica em fêmeas adultas de ratos Wistar. A avaliação funcional realizou-se usando a escala de classificação locomotora BBB de 21 pontos, o teste de locomoção em barra estreita e a análise cinemática tridimensional do movimento dos membros pélvicos em tapete rolante. A análise estereológica das medulas espinhais lesionadas, realizada oito semanas após a lesão, permitiu-nos estimar o volume e comprimento da lesão e a área de substância branca preservada no epicentro da lesão. Os nossos resultados mostraram que administração de rolipram após contusão moderada da medula espinhal proporcionou um melhor desempenho motor nos ratos lesionados durante todo o período de teste. A avaliação dinâmica do movimento do pé durante a marcha realizada oito semanas após a lesão revelou uma diminuição significativa da rotação externa durante todo ciclo de passada nos animais tratados com rolipram. A análise estereológica não revelou diferenças significativas no volume e comprimento da lesão em animais tratados e não-tratados com rolipram. Em contrapartida, a quantidade de substância branca preservada foi significativamente maior no grupo tratado com rolipram. Estes resultados sugerem um potencial terapêutico para o rolipram em situações agudas de lesão da medula espinhal. Devido às limitações da escala locomotora BBB, desenvolvemos um protocolo de análise computadorizada da marcha do rato que nos permitiu obter medições contínuas e precisas de parâmetros cinemáticos. Nesta tese fornecemos uma descrição detalhada deste protocolo e expomos de que forma superáramos as várias limitações da avaliação cinemática, nomeadamente o artefacto de deslizamento da pele, o efeito da velocidade de locomoção nos parâmetros cinemáticos e as diferenças entre as abordagens cinemáticas bidimensionais e tridimensionais. Os resultados obtidos confirmam a fiabilidade da avaliação cinemática da locomoção em tapete rolante, sempre que se minimizem as possíveis influências da velocidade de marcha, do movimento da pele a nível do joelho e dos erros de paralaxe nos parâmetros angulares obtidos durante a locomoção. Velocidades elevadas de marcha no rato originam maior extensão das articulações do membro pélvico e diminuição de parâmetros temporais como o tempo de suporte e a duração da passada. Os investigadores devem estar cientes do potencial efeito da velocidade de marcha nos parâmetros cinemáticos obtidos em modelos animais de locomoção. Demonstrámos que a análise cinemática tridimensional proporciona a obtenção de valores exatos e precisos e permite determinar as rotações externas ou internas do pé. Os nossos resultados mostraram que há um movimento considerável da pele do membro pélvico que se propaga como artefacto na determinação da posição do joelho e na análise cinemática do membro, diminuindo a fiabilidade dos dados obtidos por marcação cutânea desta articulação. A estimativa computadorizada indireta da posição do joelho reduz os efeitos deste artefacto e, por conseguinte, melhora a análise biomecânica do membro pélvico durante a locomoção.
Spinal cord injury (SCI) is a devastating condition affecting millions of people all over the world with overwhelming socioeconomic costs associated with physical disability and psychological stress. Unfortunately, despite decades of research and clinical trials, functional recovery is still very limited in patients suffering from acute or chronic spinal cord lesion. The secondary progressive tissue damage that follows the initial injury leads to a limited spontaneous regenerative response at the lesion site, but is also responsible for a multitude of cellular and molecular events that originate an inhibitory environment to axonal regeneration. Myelin-associated inhibitory components that accumulate on the lesion site, due to its very slow clearance, exert multiple inhibitory actions contributing to the inability of mature spinal cord axons to regenerate after injury. These components are responsible for triggering an intracellular cascade that results on contraction of myosin actin filaments at the filopodia originating growth cone collapse. Several studies have demonstrated that the elevation of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) can reduce this inhibitory effect and enhance the ability of spinal cord neurons to extend their damaged axons. In those studies, elevation of spinal cAMP was accomplished either by cAMP analogues administration or indirectly by inhibiting the enzymes responsible for its degradation leading to its intracellular accumulation. In this thesis we studied the effect of continuous administration of rolipram, a Phosphodiesterase 4 (PDE4) inhibitor, on locomotor recovery and spinal white matter sparing following experimental SCI. Rolipram was administered as a sole agent for two weeks following moderate thoracic spinal cord contusion injury in Wistar adult female rats. Functional assessment was performed using the 21-point Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) locomotor rating scale, beam walk test and three-dimensional kinematic evaluation of hindlimbs movement on treadmill locomotion. Stereological analysis of injured spinal cords, performed eight weeks postinjury, allowed us to estimate lesion volume, lesion length and area of spared white matter at lesion epicentre. Our results showed that administration of rolipram following acute spinal cord contusion resulted in improved motor performance during the entire testing period. Dynamic assessment of foot motion during treadmill walking revealed a significantly decreased external rotation during the entire step cycle after 8 weeks in rolipram-treated animals. Stereological analysis revealed no significant differences in lesion volume and length. By contrast, spared white matter was significantly higher in the group treated with rolipram. These results suggest a therapeutic role for rolipram delivered alone following acute SCI. Due to the limitations and subjectivity of the BBB locomotor rating scale we developed a computerized rat gait analysis protocol which allowed us to obtain and process highly accurate continuous kinematic measurements. In this thesis we provide a detailed description of this protocol and we expose how we did overcome several limitations of kinematic evaluation, namely the skin slippage artifact, the effects of speed on angular parameters and the differences between two-dimensional and threedimensional kinematic approaches. Concerning the kinematic evaluation of the rat´s hindlimbs, our results suggest that reliable kinematic measurements can be obtained from the treadmill gait analysis in rats, if the experimenter is able to minimize the potential influences of gait speed, skin movement and parallax errors on the angular parameters obtained during rat locomotion. Increased walking velocities in the rat are associated with increased hindlimb joints extension and decreased temporal parameters. Researchers should be aware of the potential role of walking velocity differences in gait research models. We demonstrated that maximal precision and accuracy of the kinematic values are expected when the experimental protocol includes a three-dimensional motion analysis methodology in order to determine the external or internal rotation of the foot. Our results revealed the presence of a considerable skin movement artifact which propagates to knee joint position and hindlimb kinematics decreasing data reliability in the research of rat gait analysis. The indirect computerized estimation of the knee position can largely reduce the effects of this artefact and therefore improve biomechanical analyses.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
URI: http://hdl.handle.net/10348/3134
Document Type: Doctoral Thesis
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