Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/4500
Título: Targeting genes for al tolerance in portuguese bread wheat (Triticum aestivum L.)
Autor: Oliveira, Ana Luísa Garcia
Orientador: Lopes, Paula Martins
Benito, César
Pinto, Henrique Guedes
Palavras-chave: Alumínio
Tolerância
Triticum aestivum
Gene
Expressão génica
Métodos de melhoramento
Data: 2013
Resumo: A tolerância à toxicidade ao aluminio (Al) é um dos maiores desafios para a produção agrícola em solos ácidos. Em Portugal, a cultura do trigo ocupa um lugar especial entre os cereais, ocorrendo a maioria do seu cultivo neste tipo de solos. O objectivo do presente estudo foi o de caracterizar, quer fisiológica quer molecularmente o genótipo Barbela 7/72/92 em relação à tolerância ao Al quando em presença de condições de pH baixo. As técnicas fenotípicas baseadas na ericromocianina R, na hematoxilina e na morina demonstraram que o Barbela 7/72/92 é um genótipo muito resistente ao Al e que o seu mecanismo de tolerância baseia-se principalmente na destoxificação externa deste elemento tóxico. Técnicas baseadas nos reagentes de Schiff e Evans blue também evidenciaram um baixo nível de peroxidação lipídica bem como a quase inexistência de danos físicos nas raízes de Barbela 7/72/92 tratadas com Al. De salientar, que o crescimento de pêlos radiculares presentes no Barbela 7/72/92 quando na presença de Al poderá indicar que este genótipo de trigo mole activa diversos mecanismos de resposta à toxicidade deste elemento. As técnicas histoquímicas utilizadas neste estudo demonstraram claramente que a toxicidade pelo Al induz múltiplos efeitos nas raízes de trigo mole. Na presente investigação, três genes candidatos, para a tolerância ao Al em trigo hexaplóide, foram clonados nomeadamente o TaMATE1 e o TaMATE2 (membros da família MATE) e o TaSTOP1 (membro da família de fatores de transcrição). O mapeamento através do recurso a linhas aneuploides de trigo da cultivar Chinese Spring, revelou que o TaMATE1, o TaMATE2 e o TaSTOP1 estão localizados no braço longo dos cromossomas 4, 1 e 3, respectivamente. No caso do gene TaSTOP1 a localização no cromossoma 3 foi igualmente confirmada por hibridação in situ no genótipo Barbela 7/72/92. A análise da expressão dos genes TaMATE1 e TaALMT1 revelou que ambos os transcriptos existem em maior abundância nas raízes comparativamente aos rebentos, contrariamente ao que foi verificado para o gene TaMATE2. Em relação ao gene TaSTOP1, o gene expressou-se equitativamente em ambos os tecidos (raízes e rebentos). A análise da expressão específica para os genes TaMATE1 e TaSTOP1 revelou claramente a transcrição não uniforme destes genes, em ambos os tecidos de trigo hexaplóide. A expressão do homólogo TaMATE1-4B foi preponderante à expressão do TaMATE1-4D em Barbela 7/72/92. Quanto ao homólogo TaMATE1-4A a sua expressão parece estar silenciada. Para o gene TaSTOP1, os níveis de expressão do homólogo TaSTOP1-A encontraram-se significativamente elevados em relação aos encontrados para TaSTOP1-B e TaSTOP1-D, em ambos os tecidos (raízes e rebentos). Os nossos resultados indicaram igualmente que o gene TaSTOP1-A possui um potencial de trans-activação constitutivo e que pode não depender da ausência/ presença do stress por Al. Em relação ao TaMATE2, não foi possível a quantificação individual de cada um dos homólogos devido à elevada similaridade verificada entre as suas sequências nucleotídicas. A expressão desigual encontrada para os genes TaMATE1 e TaSTOP1, bem como a diferente resposta à toxicidade por Al indica que os homólogos destes genes, em trigo mole, parecem de forma diferencial na presença de Al. A análise dos promotores dos homólogos do gene TaMATE1 revelou que no genótipo Barbela 7/72/92, a 25 bp a jusante, existe um transposão do tipo Sukkula no homólogo TaMATE1-4B. A subsequente análise desta região numa coleção de trigo mole Portugueses revelou uma correlação positiva entre a presença deste transposão e a tolerância ao Al. De igual modo, a sequenciação do promotor do gene TaALMT1, no Barbela 7/72/92 e no Anahuac, revelou a presença dos promotores do Tipo VI e I, respectivamente. O promotor ALMT1 tipo VI foi previamente descrito como tendo uma correlação positiva com a tolerância ao Al em trigo. Estes resultados são suportados pelas análises de expressão de ambos genes, sugerindo que o Barbela 7/72/92 possui novos alelos para os genes referidos permitindo a este genótipo um melhor desempenho quando na presença do stress pelo Al através da sua exclusão. A co-localização do TaMATE1, TaMATE2 e TaSTOP1 com regiões genómicas implicadas na tolerância ao Al nos cromossomas 4 (genoma B), 1 (genomas A e B) e 3 (genoma B), respectivamente, sugerem que estes genes podem ser um potencial alvo para a tolerância ao Al neste cereal. Em conclusão, os estudos fisiológicos e moleculares realizados neste estudo claramente demonstram que o genótipo de trigo mole Português Barbela 7/72/92 é altamente tolerante ao stress pelo Al, o qual desenvolveu diversos mecanismos de forma a adaptar-se aos solos ácidos onde é cultivado. Neste trabalho, demonstramos que o Barbela 7/72/92 possui novos alelos para múltiplos genes para a tolerância ao Al, os quais poderão vir a ser posteriormente utilizados em programas de melhoramento de trigo.
Aluminium (Al) toxicity is one of the most challenging features when dealing with crop production on acid soils. In Portugal, wheat holds among the cereals a special place in the sense that the majority of its production occurs on acid soils. The aim of the present research was to characterize the Portuguese bread wheat genotype Barbela 7/72/92 for Al tolerance, in low pH conditions, at the physiological and molecular levels. Through erichrome cynanin R, hematoxylin and morin assays it was possible to demonstrate that Barbela 7/72/92 is a highly Al resistant genotype and its resistance mechanism mainly relies on external Al exclusion. Schiff’s reagent and Evans blue procedures also showed absence of Al induced lipid peroxidation and rare physical injuries in the Al treated roots of Barbela 7/72/92. Furthermore, better root hair growth in Barbela 7/72/92 under Al stress also indicated that this Portuguese bread wheat genotype may acquire several mechanisms of Al tolerance in order to adapt to acidic soil conditions. The histochemical assays herein presented clearly demonstrated that Al toxicity induces multiple stresses in the bread wheat’s root system. In the present investigation, three candidate genes, associated with Al tolerance in bread wheat were cloned, namely TaMATE1 and TaMATE2 (MATE family), and TaSTOP1 (transcription factor family). PCR based mapping of these genes using Chinese Spring aneuploid stocks revealed that TaMATE1, TaMATE2 and TaSTOP1 are located on the long arms of homoeologous group 4, 1 and 3 chromosomes, respectively. Furthermore, the results of TaSTOP1 mapping were also validated with in situ hybridization in Barbela 7/72/92. Tissue specific expression analysis clearly revealed the higher transcript expression of TaMATE1 and TaALMT1 genes in the roots, whereas TaMATE2 showed higher transcript levels in the shoot tissues. Contrarily, TaSTOP1 seemed to be equally express in both wheat root and shoot tissues. Interestingly, homoeologue specific transcript expression clearly revealed the unequal expression of the TaMATE1 and TaSTOP1 homoeologues in bread wheat. Barbela 7/72/92 exhibited the preponderance of TaMATE1-4B transcripts followed by TaMATE1-4D, whereas homoeologue TaMATE1-4A seemed to be silenced. On the other hand, significantly higher transcript expression of TaSTOP1-A was noticed over TaSTOP1-D and TaSTOP1-B homoeologues. In addition our results also indicate that TaSTOP1-A trans-activation potential is constitutive and may not depend on the presence/absence of Al at least in yeast. The individual TaMATE2 homoeologues transcript expression quantification was not possible due to the high similarity among the nucleotide sequences present in the different homologues groups for this gene. However, the unequal transcript expression verified in TaMATE1 and TaSTOP1, and their different response to Al toxicity indicate that homoeologue(s) of these genes, in bread wheat, may differentially contribute to Al tolerance under stress conditions. The promoter analysis of TaMATE1 homoeologues revealed that Al resistant genotype Barbela 7/72/92 has a Sukkula like transposon in 25 bp upstream of TaMATE1-4B homoeologue. Further, TaMATE1-4B promoter analysis in a collection of Portuguese bread wheat genotypes revealed a correlation between the presence of this transposon and Al tolerance. Furthermore, TaALMT1 promoter sequencing also showed that Barbela 7/72/92 had a type VI promoter, whereas type I promoter was observed in Anahuac. Type VI promoter of TaALMT1 was previously reported as being associated to high Al tolerance levels in bread wheat. These results were supported by the transcript expression of both genes, suggesting that Barbela 7/72/92 has novel alleles of TaMATE1 and TaALMT1 genes that may enable it to exclude the Al toxic forms in acid soils in a more efficient way. In addition, the co-localization of TaMATE1, TaMATE2 and TaSTOP1 with previously reported genomic regions implicated with Al tolerance in bread wheat on chromosomes 4 (B genome), 1 (A and B genomes) and 3 (B genome), respectively, suggest that these genes could be potential used to improve Al tolerance in bread wheat. In conclusion, physiological and molecular studies performed in the present investigation clearly exhibited that the Portuguese bread wheat genotype Barbela 7/72/92 is highly resistant to Al stress, having developed several mechanisms to adapt to acid soils. Herein we also demonstrated that Barbela 7/72/92 possesses novel alleles, which could be used in breeding programmes to improve Al tolerance for the development of cultivars suitable for acid soils. On the other hand this study also allowed a better understanding of the molecular mechanisms involved in Al tolerance in bread wheat.
Descrição: Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/4500
Tipo de Documento: Tese de Doutoramento
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