Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/4668
Title: ERBB2 and TWIST1 genes survey in cat mammary tumours: nucleic acids sequences and expression changes
Authors: Santos, Sara Isabel Rodrigues dos
Advisor: Chaves, Raquel
Pinto, Henrique Guedes
Keywords: Oncogenes (ERBB2 e TWIST1)
Expressão génica
Gatos
Neoplasias da mama
Variantes de sequência
Issue Date: 2-Jun-2015
Abstract: As causas genéticas do cancro incluem várias alterações genómicas nomeadamente substituições/amplificações/deleções e epigenéticas que normalmente ocorrem em genes críticos de cancro, como o ERBB2 e o TWIST1. Nas lesões mamárias de gato (CML), tal como para o cancro de mama humano (HBC), os marcadores moleculares têm uma importância vital na categorização dos subtipos de lesões. Neste trabalho de doutoramento foram estudados os oncogenes ERBB2 e TWIST1 no gato, no que diz respeito ao DNA, RNA e respetivas proteínas (neste caso, apenas para o ERBB2), os quais podem estar relacionados com o início e progressão de CML. Deste modo, as potenciais correlações entre os resultados obtidos e as características das CML foram também analisadas. Este trabalho de doutoramento começou com a optimização da extracção de DNA genómico (gDNA) de elevada qualidade a partir de tecidos fixados-em-formalina e embebidosem- parafina (FFPET), que resultou num protocolo já publicado. O elevado nível da informação obtida ao longo do trabalho deveu-se à qualidade do gDNA e ao número e tamanho das sequências amplificadas, tanto nas amostras das lesões como das normais, que permitiu a deteção de variantes de sequência nos diferentes fragmentos dos genes ERBB2 e TWIST1. No primeiro estudo conduzido no gene ERBB2 no gato, o fragmento analisado incluiu os exões 17 a 20. A análise genómica revelou que 2/5 das variantes de sequência (SVs) e 2/6 dos haplotipos detetados, são exclusivos das amostras de CML. Uma associação promissora foi ainda identificada entre as variantes de haplotipos e dois fatores de prognóstico de CML: tamanho do tumor primário e número de massas. A análise bioinformática permitiu concluir que 4 das SVs detetadas podem ser responsáveis pela ocorrência de transcriptos alternativos e, consequentemente, de isoformas diferentes da proteína erbB-2. Num segundo passo, foi possível isolar a região entre os exões 10 a 15 do ERBB2 no gato. Neste fragmento foi observada uma categorização clara de haplotipos entre o normal e as CMLs. Foi ainda obtido um modelo de homologia 3D para a proteína erbB-2 do gato. A análise de 3 SVs não-sinónimas correspondentes a 3 alterações de aminoácidos, provavelmente responsáveis por danos na estrutura 3D da erbB-2, podendo ainda interferir na interacção entre a erbB-2 e o anticorpo terapêutico trastuzumab. Foi ainda analisado o status do ERBB2 em gato tendo-se concluído que não se encontra amplificado, apresentando ainda um nível mais baixo de expressão nas lesões mamárias em relação às amostras normais. Os baixos níveis de expressão de RNA do gene ERBB2, bem como da proteína foram já indicados como estando relacionados com malignidade e com mau prognóstico nas CML. Neste trabalho de doutoramento, foi pela primeira vez caracterizado o gene TWIST1 no gato, tendo sido sequenciado um fragmento de DNA com 960 bp em amostras normais. O isolamento e sequenciação de um fragmento de cDNA deste mesmo gene (201 bp) revelam que o TWIST1 é transcrito no gato, tendo-se observado um elevado grau de similaridade das sequências de DNA e cDNA desta espécie com o Homem. Foi ainda realizado o mapeamento físico in silico do gene TWIST1 no ideograma do gato, localizando-se especificamente o gene no cromossoma A2, banda q21.3. Na tentativa de compreender o papel das SVs do TWIST1 no processo tumoral mamário do gato, foram pesquisadas variantes na sequência de DNA do gene, tendo sido detetadas 2 SVs, classificadas como potenciais variantes da linha germinativa, sendo improvável a sua associação com o processo neoplásico. A análise do mRNA do gene TWIST1 no gato por qRTPCR revelou um nível mais baixo de expressão nas lesões malignas em comparação com as benignas. Os nossos resultados sugerem que a função do gene TWIST1 nas CML não está, provavelmente, relacionado com as SVs encontradas, à semelhança do que o ocorre em HBC. De uma forma geral, a importância clínica do nível reduzido e/ou da variação na expressão do TWIST1 durante o processo tumoral, sugere uma maior associação com o “switch” inicial da neoplasia e da progressão para a metastização. Em conclusão, este trabalho representa o primeiro esforço na investigação de variantes de sequência em tecidos normais e em lesões mamárias da espécie Felis catus para ambos os genes ERBB2 e TWIST1. As SVs, os haplotipos, os transcritos e as alterações detetadas na proteína do gene ERBB2 analisado e correlacionados com as características clinicopatológicas das lesões mamárias de gato, revelaram a importância deste gene nas CMLs, tal como ocorre no Homem e realçam a importância destes estudos moleculares, especialmente nos subtipos HER2 negativos. Adicionalmente, vários foram os dados obtidos e publicados ao longo deste trabalho que indicam a utilização dos tumores mamários espontâneos de gata como modelo para o HBC. No que diz respeito à avaliação do gene TWIST1 em CMLs, os níveis baixos de expressão observados nas lesões malignas estão de acordo com evidências recentes em HBC. O comportamento similar do gene nas duas espécies é encorajador para a prossecução da sua investigação, na tentativa de melhor caracterizar os padrões de expressão ao nível do RNA e da proteína em CMLs. Mais uma vez, os resultados apresentados nesta tese reúnem evidências para uma análise comparativa direita entre as lesões mamarias de gato e o cancro de mama humano.
The genetic causes of cancer include genomic sequence switches/amplifications/deletions and epigenetic alterations that often occur in cancer critical genes as ERBB2 and TWIST1 oncogenes. In cat mammary lesions (CML), as for human breast cancer (HBC), the molecular markers are greatly important to categorise lesion subtypes that define clinical and therapeutic groups. In this PhD work, cat ERBB2 and TWIST1 oncogenes were studied, concerning DNA, RNA and protein alterations (this last one, only for ERBB2), which may be related with the initiation and progression of CML. Therefore, the potential correlations between the data achieved and CMLs clinicopathological features were also analysed. This PhD work started with the optimization of genomic DNA (gDNA) extraction with high quality from formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPET) that resulted in a published protocol. The high standard in the obtained data was achieved by the gDNA quality and by the number and size of the genomic sequences amplified, from several CMLs and cat disease free samples. The large genomic sequences amplified allowed the detection of several sequence variants from several fragments of ERBB2 and TWIST1 genes. In the first study of cat ERBB2, the total fragment analysed included exons 17 to 20. The genomic analysis revealed that 2/5 of sequence variants (SVs) and 2/6 of the haplotypes detected, were exclusive of CML samples. A promising association was identified between variant haplotypes and two CMLs prognostic factors: primary tumour size and number of masses. Bioinformatics analysis indicated that 4 SVs might be responsible for alternative transcripts and, consequently, for different erbB-2 protein isoforms. In a second step, cat ERBB2 genomic sequence from exons 10 to 15 was completely obtained. Also, for the first time a tri-dimensional homology model for erbB-2 cat protein was accomplished. In ERBB2 DNA fragment, an undoubtedly haplotype categorisation distinguishes the normal from CML samples. The analysis of the 3 non synonymous SVs detected revealed to correspond to 3 amino acid changes, proposed to be probably damaging for cat erbB-2 tri-dimensional structure and may interfere with the interaction between erbB-2 protein and the therapeutic antibody trastuzumab. It was also analysed the expression status of cat ERBB2, showing no DNA amplification and a lower mRNA and protein expression levels in mammary lesions than in normal samples. Additionally, ERBB2 RNA and erbB-2 protein low expression levels were indicated as being correlated with malignity and worse clinical outcome of the mammary lesions. In this PhD work, for the first time, it was characterized the cat TWIST1 gene. A genomic fragment from the cat TWIST1 gene was isolated and sequenced in cat normal samples. The isolation and sequencing of a cat TWIST1 complementary DNA fragment (201 bp), also demonstrated that this is a transcribed gene, showing the cat TWIST1 sequences a high similarity with the human counterpart. In this work it was also in silico physically mapped TWIST1 gene in the cat G-banding ideogram, namely in chromosome A2, band q21.3. In an attempt to understand TWIST1 gene SVs role in cat mammary oncology, we searched for variants in TWIST1 DNA sequence. We detected 2 SVs, classified as potential germline variants, being improbable its association with neoplasia. The cat TWIST1 mRNA analysis by qRT-PCR revealed lower expression levels in malignant than in benign mammary lesions. Our results suggest that the role of TWIST1 gene in CML is probably not related with the observed genomic changes as referred for HBC studies. Generally, the clinical importance of the low and/or variable TWIST1 expression levels during the multistep process, point toward a major association with the initial “switch” to neoplasia and with the final progression toward metastasis. In conclusion, this work represents the first attempt to examine genomic sequence variants in normal tissues and mammary lesions from Felis catus, to both genes, ERBB2 and TWIST1. The SVs, haplotypes, transcripts and the protein changes disclosed in ERBB2 gene, associated to the CML clinicopathological features, revealed the importance of these molecular studies in CML analysis, as it happens in human and highlight the importance of these molecular studies, particularly for HER2 negative subtypes. Additionally, several were the outcomes from this work indicating the use of cat naturally occurring mammary tumours as model for human breast oncology. Considering the TWIST1 evaluation in CML, the lower RNA expression levels observed in malignant lesions are in agreement with the recent evidences for HBC. The similar behaviour of the gene in the two species encourages the development of new investigation, trying to deeper characterize its expression patterns at the level of RNA and Protein in CMLs. Once again, the results shown in this thesis gather evidences for a straightforward comparative analysis between cat mammary tumour lesions and human breast cancer.
Description: Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/4668
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:TD - Teses de Doutoramento

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