Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/4777
Title: Contributo para a caracterização da medula óssea da cabra (Capra aegagrus hircus) por citometria de fluxo
Authors: Pires, Joelma Margarida Pinheiro
Advisor: Dias, Maria Isabel Ribeiro
Keywords: Citometria de fluxo
Medula óssea
Células
Cabra
Modelo animal
Bioengenharia do tecido ósseo
Issue Date: 2013
Abstract: A medula óssea é um tecido de consistência gelatinosa que preenche a cavidade interna de vários ossos do esqueleto, podendo ser classificada em dois tipos principais: medula óssea vermelha (também designada medula óssea ativa) e medula óssea amarela. Vários estudos têm sugerido a subdivisão da medula óssea em nichos com microambientes específicos. Microscopicamente, a medula óssea é constituída, em proporções diferentes, por células hematopoiéticas e suas correspondentes células tronco hematopoiéticas e células progenitoras, células tronco mesenquimais, células do estroma, adipócitos, mastócitos (células do tecido conjuntivo) e células plasmáticas. As células tronco hematopoiéticas têm a capacidade de se diferenciarem em linfócitos (células hematopoiéticas envolvidas na resposta imune), em granulócitos (células hematopoiéticas que defendem o organismo contra bactérias), em trombócitos ou plaquetas (células hematopoiéticas responsáveis pela prevenção da hemorragia) e em eritrócitos (células hematopoiéticas vulgarmente conhecidas como glóbulos vermelhos ou hemácias, que são responsáveis pelo transporte de gases pelo sangue). Atualmente sabe-se que as células hematopoiéticas são positivas para os seguintes marcadores celulares de superfície: CD45, CD14 e CD34, os quais foram utilizados no presente estudo. As células tronco mesenquimais constituem o maior tipo de células tronco mesenquimais multipotentes, as quais podem provir de várias fontes: medula óssea, tecido adiposo, sangue periférico, pulmão ou coração. Estas células tronco são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares in vitro: osteoblastos, condrócitos, adipócitos, mioblastos, hepatócitos e possivelmente em células do tecido neural. As células tronco mesenquimais da medula óssea expressam os marcadores celulares de superfície CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD140b e CD166, mas não expressam os marcadores CD31, CD45, CD34 e CD133. A citometria de fluxo tem vindo a tornar-se a maior ferramenta para a caracterização fenotípica de células. Como ferramenta analítica, a sua capacidade única para discriminar, quantificar e classificar um elevado número de células é incomparável. Esta tecnologia quantifica e analisa em simultâneo características físicas de partículas únicas, tais como o tamanho relativo das partículas, a granularidade relativa ou complexidade interna, e a intensidade relativa de fluorescência emitida por anticorpos ou corantes, permitindo a distinção das células e o seu agrupamento em populações com características semelhantes. Nas últimas décadas, os pequenos ruminantes (ovelha e cabra) têm sido amplamente utilizados como modelos animais reconhecidos em vários projetos de investigação biomédicos, destacando-se na investigação em ortopedia. No presente estudo foram utilizadas seis cabras autóctones de raça Serrana (Capra aegagrus hircus), devidamente identificadas. Foram realizados aspirados de medula óssea e colheitas de sangue aos referidos animais, e as amostras seguiram para a realização de hemogramas, esfregaços, cultura de células, imunocitoquímica e citometrias de fluxo. Para a realização das técnicas de imunocitoquímica e citometria de fluxo foram utilizados os seguintes marcadores celulares de superfície: CD14, CD45 e CD34. Os resultados obtidos na técnica de imunocitoquímica vieram confirmar a marcação positiva dos marcadores utilizados neste estudo nas células da medula óssea da cabra. Os resultados obtidos nas citometrias de fluxo de medula óssea de cabra estavam em concordância com o descrito na literatura existente para o Homem e para a ovelha, no entanto, surgiram algumas dúvidas na interpretação dos resultados e a marcação com CD34 não foi validada para cinco dos animais em estudo. Deste estudo pudemos concluir que a cabra deverá ser um bom modelo animal para estudos de medula óssea pela técnica de citometria de fluxo, visto que houve uma boa correlação dos resultados obtidos com os resultados da citometria de fluxo de medula óssea humana. Assim, será de todo o interesse prolongar os estudos de caracterização da medula óssea da cabra com vista a aumentar o seu conhecimento para que num futuro próximo possam ser estudadas várias doenças e distúrbios, nomeadamente do sistema esquelético, e os seus resultados extrapolados para o Homem.
The bone marrow is a tissue with gelatinous consistency that fills the internal cavity of several bones throughout the skeleton. Bone marrow is classified into two basic types: red bone marrow (also called active bone marrow) and yellow bone marrow. Many studies have suggested the subdivision of bone marrow in niches with specific microenvironments. Microscopically, bone marrow is formed, in different proportions, by hematopoietic cells, and their stem cells and progenitor cells, mesenchymal stem cells, stromal cells, adipocytes, mast cells (conjunctive tissue cells) and plasma cells. Hematopoietic stem cells have the capacity to differentiate into lymphocytes (hematopoietic cells involved in immune response), in granulocytes (hematopoietic cells that defend the body against bacteria), in platelets (hematopoietic cells responsible for preventing the bleeding) and erythrocytes (hematopoietic cells commonly known as red blood cells that are responsible for transporting gases through the blood). Currently it is known that hematopoietic cells are positive for the following cell surface markers: CD45, CD14 and CD34, which have been used in this research study. Mesenchymal stem cells are the largest type of multipotent mesenchymal stem cells, which may come from several sources: bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, lung or heart. These stem cells are able to differentiate into several cell lines in vitro: osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, myoblasts, hepatocytes and possibly in neural tissue. The bone marrow MSCs express cell surface markers CD29, CD73, CD90, CD105, CD106, CD166 and CD140b, but do not express the markers CD31, CD45, CD34 and CD133. Flow cytometry has become a major tool for phenotypic characterization of cells. As an analytical tool, its unique ability to discriminate, quantify and classify a large number of cells is incomparable. This technology simultaneously analyzes and quantifies the physical characteristics of single particles, such as the relative size of the particles, relative granularity or internal complexity, and the relative intensity of fluorescence emitted by antibodies or dyes, and allowing the differentiation of the cells in clustered populations with similar characteristics. In recent decades, small ruminants (sheep and goat) have been widely used as animal models for various experimental biomedical research projects, in particular in orthopedic studies. In the present study we used six Portuguese Serrana goats (Capra hircus aegagrus), properly identified. We performed bone marrow aspirates and blood samples to these animals, the samples followed for conducting blood counts, smears, cell culture, immunocytochemistry and flow cytometry. For flow cytometry and immunocytochemistry, the following cell surface markers have been used: CD14, CD45 and CD34. The results from the immunocytochemistry confirmed the positive staining of markers used in this study on goat bone marrow cells. The results obtained in flow cytometry of goat bone marrow cells match those reported in literature for humans and sheep, however the interpretation of the final results raised a few reservations and the staining with CD34 could not be validated for five of the animals in study. From this study we conclude that goat could represent a good animal model for bone marrow studies using flow cytometry technique, since there was a good correlation of our results with the results of flow cytometry of human bone marrow. Therefore, it would be interesting to extend the studies on goat bone marrow to increase the knowledge so that in the near future some pathologies can be studied and the results extrapolated to humans.
Description: Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
URI: http://hdl.handle.net/10348/4777
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:TD - Dissertações de Mestrado

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