Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/4894
Title: Genomic and proteomic characterization of Escherichia coli and Enterococcus spp. from food-producing animals
Authors: Ramos, Sónia Catarina da Silva
Advisor: Poeta, Patrícia Alexandra Curado Quintas Dinis
Igrejas, Gilberto Paulo Peixoto
Capelo Martinez, José Luís
Keywords: Resistência microbiana a medicamentos
Bactéria (Escherichia coli, Enterococcus spp)
Genómica
Proteómica
Animais para consumo
Issue Date: 8-Sep-2015
Abstract: Actualmente em medicina humana e veterinária, o tratamento de determinadas infecções está comprometido pela resistência, manifestada por algumas bactérias, a antibióticos. Bactérias comensais, tais como Escherichia coli e Enterococcus spp., podem apresentar determinantes de resistência passíveis de ser transmitidos a outras bactérias mais patogénicas. Além disso, o Homem pode facilmente adquirir estas bactérias resistente ou os seus genes de resistência, através da cadeia alimentar. Nesse sentido, o objectivo principal deste estudo foi avaliar e caracterizar a prevalência de resistência a antibióticos em estirpes bacterianas comensais isoladas de animais abatidos para consumo humano (suínos, bovinos e ovinos). Inicialmente, foi avaliada a prevalência de resistência a antibióticos em E. coli e Enterococcus spp.. Nas amostras fecais de suínos, foi detectada uma elevada percentagem (97%) de isolados de E. coli com resistência a uma ou mais classes de antibióticos. Nas amostras fecais de ovinos e bovinos a percentagem de isolados de E. coli com resistência foi de 74% e 55%, respectivamente. Os fenótipos de resistência mais comuns foram a resistência à tetraciclina e co-resistência à tetraciclina, ampicilina, estreptomicina e sulfametoxazol-trimetoprim. Relativamente aos isolados de Enterococcus spp., e em todas as espécies animais, as percentagens de resistência à tetraciclina variaram entre os 95% e os 49%. A associação entre o gene tet(M) e um dos transposões, Tn916/Tn1545 ou Tn5397, foi encontrada em, respectivamente, 30,8% e 11,2% dos isolados tetraciclina-resistentes. Enterococcus spp. com mecanismos intrínsecos de resistência à vancomicina foram detectados em, respectivamente, 9,9%, 3,7% e 2,7% das amostras fecais de suínos, bovinos e ovinos. Mecanismos adquiridos de resistência à vancomicina, foram detectados em, respectivamente, 25,3% e 2,7% de Enterococcus faecium isolados de suínos e ovinos, mas não entre os isolados de bovinos. Todos os isolados de suínos com o gene vanA, eram, simultaneamente, resistentes à tetraciclina e à eritromicina. O elemento móvel, transposão Tn916/Tn1545, foi detectado em 90,5% dos isolados tetraciclina-resistente com o gene tet(M). Estes dados apoiam a hipótese de uma possível ligação entre a persistência de enterococci vancomicina-resistentes entre os animais de consumo e a detecção de genes codificadores de resistência aos glicopeptidos, aos macrólidos e à tetraciclina. Foi avaliada a prevalência de ß-lactamases de amplo espectro em isolados de E. coli, onde, percentagens de 49%, 9,3% e 5,5%, foram encontradas, respectivamente, em suínos, bovinos e ovinos. A enzima beta-lactamase predominante foi a CTX-M-1, seguida pela CTX-M-9, CTX-M-14, SHV-12 e CTX-M-32, sendo que, pela primeira vez, enzimas do tipo CTX-M foram reportadas em bovinos e ovinos, em Portugal. No que diz respeito ao padrão de resistência dos isolados de E coli produtores de ESBL, a maioria deles apresentou um fenótipo de multirresistência. Neste estudo observou-se, ainda, que entre 31% e 41% de estirpes de E. coli CTX-M-produtoras pertenciam ao CC10, onde se agrupam frequentemente amostras clínicas. Por fim, foi efectuada a comparação proteómica entre estirpes de E. coli, com diferentes fenótipos de resistência a antibióticos, onde, nas estirpes com resistência a β-lactâmicos, foi confirmada a expressão de proteínas ß-lactâmicas. Adicionalmente, as diferenças de expressão proteica em estirpes submetidas a stress com antibiótico foram avaliadas. Na presença de ciprofloxacina, a estirpe de E. coli produtora de ESBL apresentou uma sobre-expressão da hidrolase, L-asparaginase, que poderá ter conduzido a uma resposta secundária influenciando a produção de outras proteínas ou, eventualmente, esta poderá estar directamente implicada no mecanismo de resistência à ciprofloxacina. Por último, avaliou-se a resposta de uma estripe de enterococci vancomicina-resistentes sujeita a stress com diferentes concentrações de vancomicina, concluindo que a resposta compensatória observada foi a alteração da expressão de proteínas relacionadas com resistência, com a formação da parede celular e com o metabolismo energético. No geral, proteínas envolvidas nos mecanismos de resistência à vancomicina mostraram um aumento da sua expressão, enquanto proteínas relacionadas com o metabolismo foram sob-expressas. Com esta tese demostrou-se que em bactérias comensais de animais de consumo podemos encontrar uma alta prevalência de resistência a antibióticos, o que pode levantar importantes questões sobre uso de antibióticos em animais e o seu potencial impacto no desenvolvimento de resistência, e sobre o papel da cadeia alimentar na transmissão de bactérias resistentes, e genes de resistência, ao ser humano. Especial atenção deve ser dada à elevada prevalência de E. coli produtora de ESBL encontrada em suínos, na maioria das vezes associada a co-resistência a outros antibióticos com importância crítica em terapia humana. Logo, e considerando as implicações diretas (ou indiretas) em saúde humana, a resistência a antibióticos em animais de consumo deve ser encarada como um grave problema de segurança alimentar.
Nowadays antimicrobial resistance is compromising bacterial infections treatment in human and veterinary medicine. Commensal bacteria, such as Escherichia coli and Enterococcus spp., may carry transferable resistance determinants, which can be further transmitted to other pathogenic bacteria. Furthermore, these antimicrobial-resistant bacteria, and their genes of resistance, can easily be transmitted to Humans through the food chain. To address these questions, the main focus of this study was to assess and characterize the prevalence of antimicrobial resistance among commensal strains, isolated from food-producing animals (pigs, cattle and sheep) at slaughter level. Firstly, the prevalence rate of resistant E. coli and enterococci isolates, in the faecal flora of food-producing animals, was evaluated. Among E. coli isolates, resistance to one or more antimicrobial classes was found at extremely high levels (97%) in pigs, and at very high levels in sheep and cattle (74% to 55%, respectively); resistance to tetracycline alone, or co-resistance to ampicillin, streptomycin, tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole were the most common phenotypes detected. Concerning enterococci, tetracycline-resistance was detected at very high to high levels in all animals species (95% to 49%), and the association between the tet(M) gene and Tn916/Tn1545-like, or Tn5397-like, transposons was detected in, respectively, 30.8% and 11.2% of the tetracycline-resistant isolates. Enterococcal strains with intrinsic vancomycin resistance were detected in 9.9%, 3.7% and 2.7% of faecal samples from pigs, cattle and sheep, respectively, whereas Enterococcus faecium containing the vanA gene, encoding for acquired vancomycin resistance, were detected in 25.3% and 2.7% of pigs and sheep samples, respectively, but not among cattle samples. Moreover, all vanA-positive isolates from pigs were resistant to tetracycline and erythromycin, and the mobile element Tn916/Tn1545-like transposon was detected in 90.5% of the tetracycline-resistant isolates, supporting the hypothesis of a putative linkage between the persistence of vancomycin-resistant enterococci in food-producing animals with the detection of glycopeptide, macrolide and tetracycline-resistant genes. The prevalence rate of extended-spectrum ß-lactamses-producing E. coli isolates recovered within the faecal flora of food-producing animals was evaluated, where percentages of 49%, 9.3% and 5.5%, were found, in pigs, cattle and sheep, respectively. The prevalent ß- lactamase detected was the CTX-M-1 enzyme, followed by CTX-M-9, CTX-M-14, SHV-12 and CTX-M-32 and, for the first time, CTX-M-enzymes where reported from beef cattle and sheep in Portugal. With respect to the pattern of resistance of the ESBL producing E. coli isolates, most of them presented a phenotype of multidrug-resistance. Furthermore, in this study we also observed that 31% to 44% of CTX-M–producing E. coli strains belong to CC10, commonly recovered from clinical samples. Finally, we used a proteomic approach for comparison antibiotic-resistant E. coli strains with different phenotypes. We detected and confirmed the expression of beta-lactamase proteins in β-lactam-resistant strains. Furthermore, we assessed the differentially expressed proteins on bacterial strains subjected to antibiotic stress. The hydrolase L-asparaginase was found to be overexpressed in the ESBL-producing E. coli strain, stressed with ciprofloxacin, which could lead to a diverse secondary response, by influencing the production of other proteins or directly mediating ciprofloxacin resistance. Lastly, we assessed the response of a VRE strain, cultured with different vancomycin concentrations, concluding that the overall compensatory response was an alteration in the expression of proteins related to antibiotic resistance, cell wall formation and energy metabolism. Moreover, proteins involved in the vancomycin resistance mechanism were upregulated, while metabolism-related proteins were downregulated. This thesis showed that a high percentage of antibiotic resistance may be found in commensal bacteria of food-producing animals, raising important questions on the potential impact of antibiotic use in animals, and further, on the possible transmission of these resistant bacteria and resistance genes to humans, through the food chain. Special concern should be addressed to the wide dissemination of ESBL-producing E. coli found among pig isolates, and most often associated with co-resistance to other critically important antibiotics used in human therapy. Taken all together, and considering the direct (or indirect) implications on human health, antibiotic resistance in food-producing animals should be faced as a food safety problem.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
URI: http://hdl.handle.net/10348/4894
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:TD - Teses de Doutoramento

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
phd_scsramos.pdf6,7 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex mendeley Endnote Logotipo do DeGóis Logotipo do Orcid 

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.