Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/5295
Title: Determinação dos padrões de transcrição da sequência FA-SAT em células proliferativas: modelo celular carnivora
Authors: Escudeiro, Ana Cláudia Brandão Gomes Paulo
Advisor: Chaves, Raquel
Adega, Filomena
Keywords: DNA satélite
Cromossomas
Perfilação da expressão génica
Ciclo celular
Modelação da expressão
Issue Date: 3-Dec-2015
Abstract: A inatividade transcricional e o elevado nível de condensação foram consideradas as mais emblemáticas características da heterocromatina constitutiva durante várias décadas. Contudo, na última década sucessivas evidências têm reportado que estas sequências de DNA repetitivo são transcritas, originando RNAs não codificantes (ncRNAs) com funções na organização e regulação dos genomas. A transcrição de sequências de satDNA centroméricas (CT) e pericentroméricas (PCT) nos genomas eucariotas é atualmente incontestável, contudo muitas questões permanecem por esclarecer: Como é a transcrição das sequências de satDNA efetivamente regulada? Sequências de satDNA teloméricas são também transcritas, à semelhança dos satélites CT e PCT? Quais as funções exatas dos transcritos satélite? Será essa função partilhada por todos os eucariotas? Ou apresentarão funções específicas e distintas de espécie para espécie? O trabalho desenvolvido nesta dissertação de mestrado teve como objetivo contribuir para o avanço do conhecimento nesta área. Pretendeu-se assim analisar o perfil de transcrição e os mecanismos de regulação da sequência de satDNA major do gato doméstico, FA-SAT, em dois genomas distintos. Apesar de inicialmente isolada a partir do genoma de Felis catus (Carnivora, Felidae), esta sequência é também partilhada com elevada similaridade pelo genoma da geneta (Genetta genetta: Carnivora, Viverridae). O estudo paralelo nestas duas espécies constitui uma estratégia inovadora para analisar uma mesma sequência de satDNA localizada em dois contextos cromossómicos distintos: telomérico no gato e (peri)centromérico na geneta. A análise da transcrição FA-SAT foi realizada por Real time RT-qPCR e RNA-FISH e permitiu definir o perfil transcricional da sequência FA-SAT nas duas espécies em estudo, tendo revelado pela primeira vez atividade transcricional de uma sequência de satDNA telomérica. A análise da localização celular dos transcritos FA-SAT em Felis catus e Genetta genetta revelou a presença de ncRNAs no nucléolo e dispersos no núcleo. A análise dos transcritos nascentes evidenciou que a transcrição da sequência ocorre aparentemente em mais do que um local na célula, sugerindo a existência de mais do que um tipo de transcritos FA-SAT. A determinação dos perfis de transcrição da sequência FA-SAT evidenciou que esta ocorre de forma dependente do ciclo celular, sugerindo uma associação entre a expressão FA-SAT e a progressão no ciclo, nas duas espécies. A acumulação de ncRNAs FA-SAT em estados de quiescência/senescência foi também detetada, sugerindo o envolvimento desta sequência na regulação de acontecimentos do ciclo celular e da saída de ciclo. Neste trabalho foram ainda analisados os mecanismos de regulação da expressão FA-SAT através da utilização do agente de desmetilação global do genoma 5’-azacitidina. A modelação da expressão da sequência sugeriu a existência de uma complexa via de regulação, envolvendo aparentemente vários mecanismos reguladores sinergéticos, diferentes nos dois genomas em análise. Finalmente, a deteção de alterações nos níveis de expressão FA-SAT em condições de stress específicas revelou resultados importantes acerca dos processos em que estes ncRNAs podem estar envolvidos. A integração de todos os resultados obtidos ao longo deste trabalho permitiu evidenciar a importância que a localização cromossómica pode ter no comportamento transcricional de uma sequência de satDNA e na função dos transcritos resultantes.
The transcriptional inactivity and high level of condensation were once, and during several decades, considered the most emblematic features of constitutive heterochromatin. However, in the last decade increasing evidences suggest that these repetitive DNA sequences are transcribed and that the resulting non-coding RNAs (ncRNAs) seem to play important roles in the organization and regulation of genomes. Transcription of centromeric (CT) and pericentromeric (PCT) satDNA sequences in the genomes of many eukaryotes is currently undeniable, however many questions remain unsolved: How is the transcription of satDNA effectively regulated? Are telomeric satDNA sequences also transcribed, as CT and PCT satDNAs? What are the exact functions of these satellite transcripts? Are those functions shared by all eukaryotes? Or is the function distinct between taxa? The work developed in this master dissertation had the aim of contributing to the progress of knowledge in this area. We intended to analyze the transcription profile and the regulation mechanisms of the major satDNA sequence of the domestic cat, FA-SAT sequence, in two distinct genomes. Although originally isolated from the genome of Felis catus (Carnivora, Felidae), this sequence is also shared with high similarity by the genet genome (Genetta genetta: Carnivora, Viverridae). The study of these two species represents a good strategy for analyzing the same satDNA, naturally localized in two different chromosome locations: telomeric in cat and (peri)centromeric in genet. Transcription analysis of FA-SAT was performed by real-time RT-qPCR and RNA-FISH and allowed to define the transcriptional profile of FA-SAT in both genomes. This analysis revealed for the first time the transcriptional activity of a telomeric satellite DNA sequence. The analysis of the cellular location of FA-SAT transcripts in Felis catus and Genetta genetta revealed the presence of ncRNAs in the nucleolus and in the nucleus. The analysis of nascent transcripts showed that the transcription itself seems to occur in more than one location in the cell, suggesting more than one type of FA-SAT ncRNAs. The definition of the FA-SAT transcription profiles revealed that it is cell-cycle dependent, suggesting a correlation between the expression of FA-SAT and the cell-cycle progression in both species analyzed. The accumulation of FA-SAT ncRNAs in quiescence/senescence states was also detected, suggesting a role for this sequence in the regulation of cell cycle events and in cell cycle exit. Also the mechanisms regulating the expression of FA-SAT were analysed in this work by using the global genome demethylating agent 5'-azacytidine. The modelation of this satDNA transcription suggests the existence of a complex pathway involving several regulatory mechanisms, apparently different in the two genomes under analysis. Finally, the detection of changes in FA-SAT expression levels under specific stress conditions revealed important insights about the processes in which these ncRNAs may be involved. The results obtained in this master dissertation have highlighted the importance that the chromosomal location may have in the transcriptional behaviour of a satDNA sequence and in the function or functions of the resulting transcripts.
Description: Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/5295
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:TD - Dissertações de Mestrado

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