Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/5303
Título: Karyotype restructuring in Rodentia: from evolution to cancer
Autor: Pereira, Sandra Louzada Gomes
Orientador: Chaves, Raquel
Adega, Filomena
Palavras-chave: Citogenética
Roedores
Modelos animais
Cromossomas
Células tumorais
Data: 4-Dez-2015
Resumo: A ordem Rodentia representa a mais abundante e diversificada ordem de mamíferos. A análise dos cariótipos/genomas de roedores da superfamília Muroidea tem revelado a ocorrência de elevadas taxas de evolução para estas espécies, o que as torna bons modelos para o estudo da evolução de cromossomas, dos rearranjos cromossómicos e das consequências dos mesmos durante o processo tumoral. O principal objectivo desta tese consistiu na análise da dinâmica envolvida na reestruturação dos cariótipos durante a evolução de algumas espécies de roedores e durante o processo de cancro num modelo celular da espécie Rattus norvegicus. Os eventos que ocorrem durante a evolução dos cromossomas têm sido desvendados através da análise comparativa dos cariótipos de espécies diferentes usando técnicas de citogenética (“Comparative chromosomics”) que permitem a elaboração de mapas comparativos entre os mais diversos grupos, incluindo os Rodentia. Na presente tese foram construidos mapas cromossómicos de elevada resolução de três espécies de roedores, Praomys tulbergi (PTU, Muridae), Cricetus cricetus (CCR) e Peromyscus eremicus (PER), ambas Cricetidae. Um resultado importante foi o delineamento do cariótipo ancestral putativo dos Muroidea (AMK), baseado nas associações sinténicas do genoma modelo Mus musculus determinadas neste trabalho e em trabalhos anteriores. A análise destes mapas comparativos permitiu desvendar a arquitectura, assim como delinear a história evolutiva dos cromossomas desde o ancestral Muroidea até aos cariótipos das espécies em análise. A espécie PER revelou possuir um genoma extremamente conservado, partilhando muitas associações sinténicas com o AMK. As restantes espécies, CCR e PTU possuem genomas mais derivativos, demonstrando a ocorrência de um considerável número de rearranjos desde o AMK. A construção dos referidos mapas permitiu ainda a identificação das regiões de “breakpoint”, regiões estas que apresentam uma grande instabilidade. A presença de sequências repetitivas (constituintes da heterocromatina constitutiva -HC) nesses “breakpoints” evolutivos tem sido demonstrada em vários estudos, tendo sido a HC considerada como uma região propícia (“hotspot”) à ocorrência de rearranjos cromossómicos. Nos genomas analisados (PTU, CCR e PER) foi encontrada uma elevada co-localização da HC com os “breakpoints” evolutivos, indicando o envolvimento da HC na ocorrência dos rearranjos cromossómicos observados, sendo o seu maior constituinte - o DNA satélite - o melhor candidadato a promover esta plasticidade. O DNA satélite é composto por sequências altamente repetidas e dinâmicas e é o principal constituinte dos centrómeros funcionais, tendo também sido descrito em regiões teloméricas e intersticiais. O cariz enigmático das sequências de DNA satélite , conjugado com a existência de uma grande variedade de famílias diferentes, conservadas ou divergentes entre espécies e possível função nos genomas, ilustram a importância do estudo destas sequências. No presente trabalho é descrito o isolamento de novo de duas sequências repetitivas (CCR4/10sat e PMSat) por microdissecção a laser, e a sua caracterização molecular. Ambas as sequências revelaram estar presentes no genoma de diferentes espécies de roedores, apresentando, no entanto diferentes perfis, facto que evidencia a sua importância e dinamismo na reestruturação destes genomas. Enquanto que a evolução do CCR4/10sat parece dever-se a movimentos intragenómicos, as características demonstradas pelo PMSat indicam que o seu percurso evolutivo está relacionado com variações no número de cópias. A constante evolução e o elevado grau de dinamismo são também característicos dos genomas tumorais. A parte final do presente trabalho descreve a caracterização genética/citogenética de duas linhas celulares comerciais de tumor de mama de ratazana: HH-16 cl.2/1 e HH-16.cl.4. A análise citogenética revelou a presença de alterações consideráveis nos seus cariótipos, sugerindo a ocorrência de instabilidade cromossómica (“chromosomal instability”- CIN) e instabilidade estrutural dos cromossomas (“chromosome structure instability”- CSI). Vários estudos revelaram que a CSI pode influenciar a tumorigénese através da desregulação de genes específicos ou mediante fusão de genes. O trabalho permitiu determinar os rearranjos cromossómicos que das linhas celulares em análise, bem como de dois oncogenes - Mycn e Erbb2, afectados por esses mesmos rearranjos. Ambas as linhas celulares revelaram diferentes níveis de expressão do gene Erbb2. Para além disso, na linha HH-16.cl.4 a expressão deste gene parece ser afectada pela desmetilação global do genoma (tratamento com 5-aza-2’- deoxicitidina), sugerindo a acção de reguladores negativos da expressão do Erbb2. Tendo por base os resultados de caracterização citogenética, expressão de genes e análise de metilação, sugeriu-se o envolvimento de mecanismos diferentes na progressão tumoral das duas linhas celulares, evidenciando o potencial das linhas HH-16 cl.2/1 e HH-16.cl.4 como modelo celular para o estudo dos mecanismos epigenéticos associados ao Erbb2, bem como potenciais ferramentas experimentais para o desenvolvimento de novas bioterapias. A presente tese de doutoramento resultou na elaboração de cinco artigos científicos que foram submetidos/publicados em jornais científicos.
The order Rodentia represents the most abundant and diversified order of living mammals. Record high rates of karyotype evolution are found in the rodent’s superfamily Muroidea (the most evolutionary successful mammalian species) making them the perfect organisms for studying chromosome evolution and powerful tools also in the study of chromosome rearrangements and their consequences in cancer. The major goal of the present thesis was the analysis of the karyotype restructuring dynamics, both during species evolution and cancer. Chromosomal evolutionary events are disclosed by the comparative analysis of different species karyotype using cytogenetic techniques, allowing the fast generation of large scale comparative maps in diverse groups including Rodentia. The present thesis describes the construction of high resolution chromosome maps of three Rodentia species, namely one Muridae species, Praomys tullbergi, and two Cricetidae Cricetus cricetus and Peromyscus eremicus. One important outcome presented here is the delineation of the Ancestral Muroidea Karyotype (AMK), based in the analysis of the Mus musculus syntenic associations outlined by several works and supported by the results obtained. The assembling of these comparative maps permitted the disclosure of genome architecture, as well as the delineation of the chromosome evolutionary history since the common Muroidea ancestor for these species. Peromyscus eremicus reveled to possess a highly conserved genome sharing most of the identified syntenic association with the AMK. Cricetus cricetus and Praomys tullbergii, on the other hand, showed to have more derivative genomes accounting a large number of large-scale rearrangements occurred since the AMK, mostly fusion events. The construction of the comparative maps allowed also the identification of the evolutionary breakpoint regions. The presence of repetitive sequences at evolutionary breakpoints has been shown by whole genome alignment studies, and constitutive heterochromatin (CH) has been considered as hotspot for structural chromosome rearrangements. Here we have found a high co-localization of CH with the identified evolutionary breakpoints for the species in analysis (P. tullbergi, C. cricetus and Peromyscus eremicus), clearly indicating its involvement in the structural chromosome rearrangements. Besides, its constituents, such as the satellite DNA, are most likely the responsible for promoting the genomic plasticity and consequently the higher rates of chromosome rearrangements observed. Satellite DNAs and thus thought to be implicated in karyotype restructuring, both in species evolution and cancer. Satellite DNAs are highly repeated sequences, characterized by a a dynamic behavior and the major constituents of functional centromeres; however being also found in telomeres and interstitial positions. The potential functional importance of satellite DNAs and the existence of a whole range of satellite sequences either conserved or divergent, even between closely related species, highlight the importance of studying satellite DNA. In the presented study two repetitive sequences (CCR4/10sat and PMSat) were isolated de novo using laser microdissection, physically mapped and molecularly characterized. Both sequences revealed to be shared by different rodent species enlightening a dynamic behavior and possible implication in karyotype architecture in rodents (Cricetidae). While CCR4/10sat evolution seems to be related with intragenomic movements, the evolutionary pathway of PMSat occurred through copy number variations, culminating in different profiles. Cancer chromosomes are known to exhibit high levels of complexity and the ability to constantly evolve. Understanding the genetic etiology of the cancer genome is important to comprehend the mechanisms for cancer initiation and progression. The last part of this thesis was dedicated to the genetic/cytogenetic characterization of two DMBA-induced rat mammary tumor cell lines: HH-16 cl.2/1 and HH-16.cl.4. The cytogenetic analysis of both cell lines revealed significant changes in their karyotypes, suggesting the presence of chromosomal instability (CIN) and chromosome structure instability (CSI). It has been demonstrated that CSI can influence tumorigenesis by deregulating expression of specific target genes or by promoting gene fusion. In the present case it was clear the implication of chromosome rearrangements and karyotype restructuring in tumor progression, specifically by causing changes in two oncogenes copy number (Mycn and Erbb2). Both cell lines showed different expression profiles regarding the intensely studied Erbb2. Besides, the expression of Erbb2 in the HH-16.cl.4 rat cell line appears to be affected by global genome demethylation (after 5-Aza-2’-deoxicitidine), suggesting the action of negative regulators of Erbb2 expression. The different outcomes for both tumor cell lines, regarding cytogenetic characterization, gene expression and methylation analysis, suggests different mechanisms involved in tumor progression. This study highlights HH-16 cl.2/1 and HH-16.cl.4 potential as models for studying Erbb2 associated mechanisms and as experimental tools to assist in the generation of new biotherapies. The present thesis resulted in the elaboration of five articles that were submitted/published in scientific journals.
Descrição: Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/5303
Tipo de Documento: Tese de Doutoramento
Aparece nas colecções:TD - Teses de Doutoramento

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