Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/5535
Title: Probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) and rearing environment. Importance in the prevention of fish diseases and public health
Authors: Araújo, Carlos Alexandre Dias
Advisor: Igrejas, Gilberto Paulo Peixoto
Poeta, Patrícia Alexandra Curado Quintas Dinis
Izarra, Luis Miguel Cintas
Keywords: Aquicultura
Oncorhynchus mykiss (truta arco-íris)
Probióticos
Bactérias ácido-lácticas
Bacteriocina
Biotecnologia
Peixe
Combate às doenças
Issue Date: 3-Feb-2016
Abstract: A aquicultura é um dos sectores alimentares que tem crescido mais rapidamente em todo o mundo. Sendo uma atividade económica importante em muitos países contribuiu para o aumento da procura de alimentos de origem aquática. A utilização de bactérias ácido-lácticas (LAB) como probióticos constitui uma alternativa aos antibióticos e à vacinação no controlo das doenças dos peixes de aquicultura, incluindo a lactococose causada por Lactococcus garvieae. No Capítulo 1, a microbiota cultivável total (TM) e as LAB de truta arco-íris e do seu ambiente aquícola, em diferentes estados do ciclo de vida, foram isoladas e identificadas taxonomicamente. Enterobacteriaceae e Aeromonadaceae foram prevalentes na TM, enquanto o género Lactococcus foi a LAB predominante. De um total de 1620 LAB selecionadas aleatoriamente, 1159 isolados (71,5%) apresentaram atividade antimicrobiana contra os principais patógenos de peixes, incluindo 248 isolados (21,4%) que apresentaram atividade antimicrobiana contra, pelo menos, quatro patógenos de peixes. A identificação taxonómica revelou que Lactococcus lactis foi a espécie mais comum (164 isolados, 66,1%). A inocuidade, a relação genética e a actividade bacteriocinogénica de 75 estirpes de Lc. lactis com potencial probiótico foram avaliadas ao longo do Capítulo 2. Adicionalmente, a bacteriocina mais ativa contra a lactococose foi caracterizada ao nível bioquímico e genético. Dezassete estirpes (22%) produziram, pelo menos, uma amina biogénica, e 30 estirpes (40%) foram resistentes contra, pelo menos, um antibiótico. Os genes tet(K), tet(O) e tet(T) foram detetados pela primeira vez em Lc. lactis. A desconjugação dos sais biliares, produção de gelatinase e hemolisina tal como a degradação da mucina não foram observados. ERIC-PCR permitiu agrupar os lactococcos em três grupos altamente divergentes (31,0% de similaridade). Nove estirpes (12%) foram identificadas como produtoras de bacteriocinas e mediante purificação, espectrometria de massa e sequenciação de DNA da bacteriocina produzida por Lc. lactis subsp. cremoris WA2-67, foi possível identificar esta bacteriocina como nisina Z (nisZ). Trinta e quatro lactococos supostamente inócuos (45,3%) foram identificados, incluindo a estirpe bacteriocinogénica Lc. cremoris WA2-67. No Capítulo 3 foram estudadas a inocuidade, a relação genética e a atividade bacteriocinogénica de oito estirpes de Pediococcus acidilactici isoladas da ração e de larvas de truta arco-íris. Além disso, a bacteriocina produzida pela estirpe mais ativa para ser utilizada como probiótico na aquicultura foi caracterizada ao nível bioquímico e genético. Nenhum dos pediococos foi resistente aos antibióticos, produziu hemolisina ou gelatinase, degradou a mucina gástrica ou desconjugou os sais biliares, ainda que apenas quatro estirpes produziram tiramina ou putrescina. ERIC-PCR permitiu agrupar os pediococos em dois grupos bem definidos (68,0% de similaridade). Seis estirpes (75%) foram identificadas como bacteriocinogénicas e mediante purificação, espectrometria de massa e sequenciação de DNA da bacteriocina produzida por P. acidilactici L-14 foi possível identificar esta bacteriocina como pediocina PA-1. Quatro pediococos supostamente inócuos (50%) foram identificados, incluindo a estirpe bacteriocinogénica P. acidilactici L-14. No decorrer do Capítulo 4, estudou-se a inocuidade e atividade antimicrobiana contra patógenos de 64 enterococos identificados taxonomicamente isolados de truta arco-íris, ração e ambiente aquícola. Enterococcus faecium e Enterococcus hirae foram as espécies mais comuns (42,2 e 35,9%, respetivamente). Quarenta e oito estirpes (75%) foram fenotipicamente resistentes a pelo menos um antibiótico. Deste conjunto, 25 estirpes (39,1%), continham, pelo menos, um gene de resistência a antibióticos [erm(B), tet(M), tet(S), tet(K), tet(L), tet(T), vanC2 e aad(E)]. Detetou-se uma estirpe gelatinase positiva, e não se observou a produção de hemolisina, desconjugação de sais biliares e degradação de mucina. Vários genes de virulência foram detetados, incluindo gelE (46,9%), efaAfs (17,2%), agg (1,6%), e hyl (1,6%). Quarenta e oito estirpes inibiram o crescimento de, pelo menos, um dos patógenos de peixes testados, incluindo 21 (43,8%) estirpes que continham, no mínimo, um gene que codifica bacteriocina (entP, entL50A and entL50B, hirJM79, entSE-K4, entQ and entA). De um total de 17 enterococos (26,6%) considerados como supostamente inócuos, seis estirpes continham, pelo menos, um gene que codifica bacteriocina. As propriedades probióticas in vitro de três estirpes Lc. cremoris bacteriocinogénicas, a capacidade in vivo de Lc. cremoris WA2-67 para proteger a truta arco-íris contra a lactococose e o papel da produção de NisZ como um mecanismo anti-infeccioso foram analisadas no Capítulo 5. As três estipes de Lc. cremoris mostraram capacidade para sobreviver em água doce, meio ácido e bílis, e exibiram diferente hidrofobicidade da superfície celular (37,93-58,52%). A estirpe selvagem Lc. cremoris WA2-67 e o seu mutante não-bacteriocinogénico Lc. cremoris WA2-67 ΔnisZ foram administrados oralmente à truta arco-íris durante 21 dias e, posteriormente, os peixes foram infetados com Lc. garvieae pelo método de coabitação. A mortalidade observada nos peixes alimentados com a estirpe bacteriocinogénica Lc. cremoris WA2-67 (20%) foi significativamente (p <0,01) inferior à observada nos peixes tratados com a estirpe mutante (50%) e no grupo controlo (72,5%). Neste trabalho demonstrou-se que as LAB isoladas diretamente do hospedeiro, ativas contra patógenos de peixes, englobam potenciais candidatos a probióticos. Os resultados obtidos através da avaliação biotecnológica sugerem que a estirpe Lc. cremoris WA2-67 produtora de NisZ poderia ser utilizada na aquicultura para evitar a lactococose na truta arcoíris.
Aquaculture is the fastest-growing food-producing sector worldwide and an important economic activity in many countries, contributing to the increasing demand for food of aquatic origin. The use of lactic acid bacteria (LAB) as probiotics constitutes an alternative to chemotherapy and vaccination to control fish diseases in aquaculture, including lactococcosis caused by Lactococcus garvieae. In Chapter 1, the cultivable total microbiota (TM) and LAB from rainbow trout and rearing environment from selected stages of the life-cycle was isolated and taxonomically identified. Enterobacteriaceae and Aeromonadaceae were clearly prevalent in the TM while the genus Lactococcus was the predominant LAB. From a total of 1,620 randomly selected LAB, 1,159 isolates (71.5%) showed antimicrobial activity against the main fish pathogens, including 248 isolates (21.4%) that showed antimicrobial activity against, at least, four fish pathogens. The taxonomical identification revealed that Lactococcus lactis was the most common species (164 isolates, 66.1%). The safety assessment, genetic relatedness and bacteriocinogenic activity of 75 potential probiotic Lc. lactis strains were evaluated in Chapter 2. Moreover, the biochemical and genetic characterization of the bacteriocin most active against lactococcosis was performed. Seventeen strains (22%) produced, at least, one biogenic amine, and 30 strains (40%) showed resistance to, at least, one antibiotic. The genes tet(K), tet(O) and tet(T) were detected for the first time in Lc. lactis. Hemolysin and gelatinase production, mucin degradation and bile salts deconjugation were not found. ERIC-PCR allowed clustering the lactococci in three highly divergent groups (31.0% similarity). Nine strains (12%) were identified as bacteriocin producers and the purification, mass spectrometry and DNA sequencing of the bacteriocin produced by Lc. lactis subsp. cremoris WA2-67 revealed its identity to nisin Z (nisZ). Thirty four putatively safe lactococci (45.3%) were identified, including the bacteriocinogenic strain Lc. cremoris WA2-67. In Chapter 3, the safety assessment, genetic relatedness and bacteriocinogenic activity of eight Pediococcus acidilactici strains isolated from rainbow trout feed and larvae were evaluated. Furthermore, the biochemical and genetic characterization of the bacteriocin produced by the strain more interesting for being used as probiotic in aquaculture was performed. None of the pediococci showed antibiotic resistance nor produced hemolysin or gelatinase, degraded gastric mucin or deconjugated bile salts, and only four strains produced tyramine or putrescine. ERIC-PCR allowed clustering the pediococci in two well-defined groups (68.0% similarity). Six strains (75%) were identified as bacteriocin producers and the bacteriocin produced by P. acidilactici L-14 was purified, and mass spectrometry and DNA sequencing revealed its identity to pediocin PA-1. Four putatively safe pediococci (50%) were identified, including the bacteriocinogenic P. acidilactici L-14. In Chapter 4, the taxonomical identification, safety assessment and antimicrobial activity against fish pathogens of 64 enterococci isolated from rainbow trout, feed and rearing environment were evaluated. Enterococcus faecium and Enterococcus hirae were the most common species (42.2 and 35.9%, respectively). Forty-eight strains (75%) showed phenotypic resistance to, at least, one antibiotic, and from these, 25 strains (39.1%) harbored, at least, one antibiotic resistance gene [erm(B), tet(M), tet(S), tet(K), tet(L), tet(T), vanC2, and aad(E)]. Gelatinase production was detected in one strain; however, hemolysin production, bile salts deconjugation and mucin degradation were not detected. Several virulence genes were detected, including gelE (46.9%), efaAfs (17.2%), agg (1.6%), and hyl (1.6%). Forty-eight strains exerted antimicrobial activity against, at least, one of the tested fish pathogens, including 21 (43.8%) strains harboring, at least, one bacteriocin-encoding gene (entP, entL50A and entL50B, hirJM79, entSE-K4, entQ and entA). From a total of 17 enterococci (26.6%) considered as putatively safe, six strains harbored, at least, one bacteriocin-encoding gene. The in vitro probiotic properties of three bacteriocinogenic Lc. cremoris, the in vivo ability of Lc. cremoris WA2-67 to protect rainbow trout against lactococcosis infection and the role of NisZ production as an anti-infective mechanism were evaluated in Chapter 5. The three Lc. cremoris showed ability to survive/tolerate the freshwater, acidic and bile environment, and different cell surface hydrophobicity (37.93–58.52%). The wild-type NisZproducer Lc. cremoris WA2-67 and its non-bacteriocinogenic mutant Lc. cremoris WA2-67 ΔnisZ were administered orally to rainbow trout for 21 days and, afterwards, fish were challenged with Lc. garvieae by the cohabitation method. The fish fed with the bacteriocinogenic strain Lc. cremoris WA2-67 reduced significantly (p<0.01) the mortality (20%) compared to the fish treated with its non-bacteriocinogenic knockout isogenic mutant (50%) and the control (72.5%). This thesis showed that host-derived LAB active against fish pathogens comprise potential candidates as probiotics in rainbow trout farming. Our results suggest that the wild type NisZ-producer strain Lc. cremoris WA2-67 could be used in fish farming to prevent lactococcosis in rainbow trout.
Description: Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/5535
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:TD - Teses de Doutoramento

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