Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/5556
Título: Targeting the adenosine A2B receptor may attenuate cardiac remodelling secondary to pulmonary hypertension
Autor: Gonçalves, Mafalda Bessa Martins
Orientador: Sousa, Ana Patrícia Fontes de
Silva, Amélia Maria Lopes Dias da
Palavras-chave: Circulação pulmonar
Hipertensão
Remodelação ventricular
Monocrotalina
Adenosina
Ratazana
Modelo animal
Data: 2015
Resumo: A Hipertensão Arterial Pulmonar (HAP) é uma doença complexa e multifactorial que induz uma sobrecarga no coração, devido ao aumento da resistência da circulação pulmonar. Neste cenário de aumento de resistência da circulação pulmonar, o lado direito do coração fica sobrecarregado, conduzindo à remodelação tissular do miocárdio e, eventualmente, falência do ventrículo direito (VD). A adenosina (ADO) é uma molécula de sinalização que é ubíqua e capaz de modular a função cardíaca mediante a interação com vários subtipos de recetores (A1AR, A2AAR, A2BAR e A3AR). Tem sido descrito que o bloqueio do A2BAR protege o pulmão da inflamação e fibrose, em doenças pulmonares intersticiais, embora o papel exato deste recetor sobre a progressão da remodelação ventricular na HAP, permaneça indefinido e largamente inexplorado. Neste contexto, o presente estudo pretendeu investigar o papel do A2BAR na disfunção cardíaca secundária à HAP realizando estudos in vitro com aurículas isoladas, tiras de VD e fibroblastos cardíacos (FC) em cultura. A HAP foi induzida em ratazanas Wistar machos que receberam aleatoriamente uma única injeção subcutânea de monocrotalina (grupo MCT) ou veículo (grupo CTRL). Os estudos ecocardiográficos, hemodinâmicos, miográficos (aurículas espontaneamente contráteis e tiras de VD eletricamente estimuladas) e análises morfométricas e histológicas foram realizados 21 a 25 dias após a administração de monocrotalina ou solução salina. Foram também realizados estudos de proliferação e produção de colagénio tipo I em culturas primárias de FC isolados a partir de VD. Observou-se que o A2BAR não parece modular a frequência nem a capacidade contráctil das aurículas a contrair espontaneamente, em ambos os grupos experimentais. A ativação seletiva do A2BAR, em tiras de VD, com o BAY 60-6583 (0.01–10 μM) foi desprovida de efeito inotrópico tanto em ratazanas CTRL como MCT. Contudo, o prétratamento das tiras de VD com o antagonista A2BAR, PSB 603 (100 nM), converteu o efeito inotrópico negativo do agonista não seletivo da ADO, NECA (0.01–100 μM), num efeito inotrópico positivo no grupo MCT, ao contrário do que foi observado em ratazanas CTRL. O efeito do PSB 603 (100 nM) não foi mimetizado pela inibição de algumas vias de sinalização classicamente associadas à ativação A2BAR, como a ciclase do adenilato, a fosfolipase C e a proteína cinase C. Os estudos de imunofluorescência revelaram que os cardiomiócitos de VD de ratazanas CTRL e MCT apresentavam pequenas quantidades de A2BAR. Além disso, o miocárdio ventricular direito de animais com HAP apresentava infiltrados celulares imunoreativos para A2BAR nos espaços intersticiais. Estes infiltrados celulares exibiram também imunoreatividade positiva para marcadores celulares como a vimentina (fibroblastos) e CD11b (macrófagos/monócitos). No que concerne aos FC isolados de ratazanas adultas dos grupos CTRL e MCT, estes apresentaram características de miofibroblastos já que possuiam imunorreatividade contra o domínio do recetor discoide 2 (DDR2), vimentina e actina muscular lisa (α-SMA). A incubação das culturas de FC com NECA (10 μM) aumentou a sua proliferação/viabilidade bem com a produção de colagénio do tipo I. O efeito promotor da proliferação observado com a NECA foi significativamente atenuado na presença do antagonista A2BAR, PSB 603 (100 nM), em animais MCT. O mesmo não foi observado nos animais CTRL, sugerindo que a ativação A2BAR favorece a proliferação dos FC induzida pela NECA nos animais com HAP. Resumindo, os dados mostraram que a ativação do A2BAR contribui para a diminuição da contratilidade do VD nos animais com HAP. Este efeito poderá estar relacionado com a infiltração dos espaços intersticiais do miocárdio do VD dos animais com HAP por fibroblastos e células inflamatórias que exibem imunoreactividade contra o A2BAR. A ativação destes receptores potencia a proliferação dos FC e a fibrose miocárdica, podendo ainda os infiltrados celulares detectados serem responsáveis pela libertação de mediadores químicos com características inibidoras da performance contrátil dos cardiomiócitos em animais com HAP. O impacto clínico da manipulação terapêutica dos receptores A2BAR localizados nos fibroblastos e células inflamatórias dos insterstícios miocárdicos na progressão da insuficiência cardíaca direita em indivíduos com HAP carece de estudos complementares de longa duração in vivo, incluindo ensaios hemodinâmicos, ecocardiográficos, morfométricos e histológicos.
Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a complex and multifactorial disease that overloads the heart by increasing the resistance of pulmonary circulation. In this scenario of higher pulmonary circulatory resistance, the right side of the heart becomes overloaded, leading to myocardial tissue remodelling and eventually right ventricle (RV) failure. Adenosine (ADO) is a ubiquitous signalling molecule that is capable of modulating cardiac function through the interaction of receptor subtypes (A1AR, A2AAR, A2BAR and A3AR). It has been described that blockade of A2BAR protects lung from inflammation and fibrosis in interstitial pulmonary diseases, although the precise role of this receptor on progression of ventricular remodeling to heart failure in PAH remains inconclusive and largely unexplored. In this context, this study was designed to investigate the role of A2BAR in cardiac dysfunction secondary to PAH, by performing in vitro studies with isolated atria, RV strips and cardiac fibroblasts (CF) in culture. PAH was induced in male Wistar rats that were randomized to receive a single subcutaneous injection of MCT (MCT group) or vehicle (CTRL group). Echocardiographic, hemodynamic, myographic studies (spontaneously beating atria, RV strips electrically paced at 2 Hz-frequency), and morphometric and histological analysis were performed 21-25 days after MCT or saline administration. Proliferation and type I collagen studies of primary cultures of CF isolated from RV were also carried out. We observed that A2BAR did not seem to modulate the rate or tension of spontaneously beating atria in both experimental groups. In RV strips, the selective activation of the A2BAR with BAY 60-6583 (0.01–10 μM) was devoid of effect in inotropy in both CTRL and MCT rats. However, pre-treatment of RV strips with the A2BAR antagonist, PSB 603 (100 nM), converted the negative inotropic effect of the non-selective ADO receptor agonist, NECA (0.01–100 μM), into a mild positive inotropic action in the MCT group, contrary to what was observed in CTRL rats. The effect of PSB 603 (100 nM) was not mimicked by inhibiting some of the signalling pathways classicaly associated to A2BAR activation, such as adenylate cyclase, phospholipase C and protein kinase C. Immunofluorescence studies revealed that RV cardiomyocytes from CTRL and MCT rats expressed small amounts of A2BAR. Furthermore, RV myocardium of PAH animals exhibited A2BAR immunoreactive cell infiltrates at interstitial spaces. These cell infiltrates also exhibited positive immunoreactivity against vimentin (fibroblasts) and CD11b (macrophages/monocytes) cell markers. With respect to CF isolated from adult rats of CTRL and MCT groups, these had features of myofibroblasts since they possessed immunoreactivity against discoidin domain receptor 2 (DDR2), vimentin and α-smooth muscle actin (α–SMA). Incubation of CF cultures with NECA (10 μM) increased the viability/proliferation as well as type I collagen production. The proliferation promoter effect observed with NECA was significantly attenuated in the presence of A2BAR antagonist, PSB 603 (100 nM), in MCT animals. The same was not observed in CTRL animals, suggesting that A2BAR activation favours CF proliferation induced by NECA in PAH rats. In summary, data showed that A2BAR activation contributes to the reduction of RV contractility in PAH animals. This effect may be related to infiltration of RV myocardial interstitial spaces of PAH animals with fibroblasts and inflammatory cells that exhibited immunoreactivity against A2BAR. Activation of these receptors enhances CF proliferation and myocardial fibrosis. Detected cell infiltrates may be responsible for the release of chemical mediators with inhibitory characteristic of contractile performance of cardiomyocytes in PAH animals. The clinical impact of therapeutic manipulation of A2BAR located on fibroblasts and inflammatory cells, in the myocardial interstices, in progression of right heart failure in PAH patients, lacks further in vivo long-term studies, including hemodynamic, echocardiographic, morphometric and histological studies.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/5556
Tipo de Documento: Dissertação de Mestrado
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