Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/5602
Título: Screening of heterologous cytochrome P450 monooxygenases for key catalytic activities involved in the biosynthesis of the anticancer alkaloids from Catharanthus roseus
Autor: Coelho, Diogo Francisco Maurício
Orientador: Sottomayor, Mariana
Chaves, Raquel
Palavras-chave: Catharanthus roseus
Alcalóides de indol
Citocromos
Variação genética
a-3',4'- anidrovinblastina
Data: 2015
Resumo: Catharanthus roseus (L.) G. Don é comumente denominada vinca de Madagáscar e é uma planta medicinal que tem sido ao longo dos anos objeto de um estudo intensivo. As propriedades medicinais desta planta começaram empiricamente a ser exploradas na antiguidade, mas foi a partir dos anos cinquenta que esta planta recebeu uma maior atenção por parte de diversos grupos de investigação, resultado do isolamento de dois alcaloides anticancerígenos a partir das suas folhas, vinblastina e vincristina. Para além destes alcaloides, até à data, sabe-se que C. roseus é uma “fábrica de compostos químicos”, com a capacidade de produzir cerca de 130 alcaloides indolicos terpenoides (AIT), incluindo outros com distintas propriedades farmacológicas, tais como atividade hipotensora. A vinblastina e vincristina são acumulados nas folhas de C. roseus em baixas quantidades, tornando a sua produção industrial um processo dispendioso. Portanto, a via de AIT tem sido estudada intensivamente ao longo dos anos, e as novas tecnologias “omicas” têm sido preponderantes nos recentes avanços. No entanto esta via é muito complexa, apresentando uma grande compartimentação a nível intra e intercelular, uma grande quantidade de compostos químicos e etapas bastante reguladas, o que continua a desafiar os investigadores. Consequentemente, os esforços para aumentar a produção destes alcaloides não têm sido bem sucedidos até à data. Algumas das reações não caracterizadas na biossíntese dos AIT são potencialmente mediadas por citocromos P450 (CIPs). O CIP BM3, um CIP de Bacillus megaterium é uma enzima com grande atividade que sofreu uma extensiva diversificação genética para aceitar uma ampla gama de substratos, uma característica comum com os CIPs humanos envolvidos no metabolismo de drogas. Portanto, o objetivo deste estudo foi verificar se os CIPs BM3 e humanos selecionados têm capacidade de executar os passos não caracterizados/limitantes na via dos AIT, levando a formação dos alcaloides anticancerígenos de C. roseus. Neste trabalho, a expressão de 10 variantes recombinantes do CIP BM3 em E. coli e 8 CIPs humanos recombinantes em levedura foi tentada. Uma quantidade significativa de proteína funcional foi conseguida para 6 variantes do CIP BM3 e a sua atividade de conversão de diversos AIT foi avaliada. AIT testados incluem tabersonina, α-3’,4’-anidrovinblastina e vinblastina, substituída pela vindolina, com o objetivo de investigar se os BM3 têm potencial para serem utilizados na engenharia da via dos AIT. Apesar das condições de ensaio exigirem mais otimizações, e dos produtos necessitarem de caracterização, a variante 2571 correspondendo a BM3 9-10A F87V TS – 8C7 demonstrou resultados promissores. Outras variantes demonstraram sinais de afinidade para com α-3’,4’-anidrovinblastina. Os CIPs humanos revelaram uma expressão mais difícil e esse processo requer otimizações. Finalmente, foi possível concluir que as variantes do CIP BM3 são expressas em células de planta e apresentam localização citoplasmática em células de folha de C. roseus. Esta informação é relevante para o planeamento de futuras estratégias de engenharia de C. roseus utilizando o CIP BM3. Globalmente, este estudo forneceu informações importantes e experiência para a futura implementação de estratégias baseadas nos CIPs para o melhoramento ou diversificação da via dos AIT de C. roseus através de engenharia metabólica.
Catharantus roseus (L.) G. Don is commonly known as Madagascar periwinkle and is a medicinal plant that has been the subject of intense study. The medicinal properties of this plant were empirically exploited since ancient times but it was from the nineteen-fifties that this plant started receiving a growing attention from several research groups, as a result of the isolation of two anticancer alkaloids from its leaves, vinblastine and vincristine. In addition to these alkaloids, to date it is known that C. roseus is a chemical factory with the ability to produce more than 130 terpenoid indole alkaloids (TIAs), including others with further pharmacological properties, such as hypotensive activity. The anticancer vincristine and vinblastine are accumulated by C. roseus in extremely low levels, making their industrial production an expensive process. Therefore, the TIA pathway has been intensively studied over the years, and the new “omic” technologies have been instrumental in fast recent advances. However, this is a very complex pathway, displaying a high intra and intercellular compartmentalization, a large range of chemical compounds and a tight regulation that continue to challenge researchers. Therefore, efforts to increase production of these alkaloids have not been successful so far. Some of the key uncharacterized bottleneck reactions of TIA biosynthesis are potentially mediated by cytochromes P450 (CYPs). CYP BM3 from Bacillus megaterium is a highly active enzyme that has undergone extensive genetic diversification to accept a wide range of substrates, a feature common with human CYPs involved in drug metabolism. Therefore, the goal of this study was to screen the potential of selected CYP BM3 and human CYPs to function as heterologous surrogates for uncharacterized and/or bottleneck steps of the TIA pathway leading to the anticancer alkaloids of C. roseus. Here, the overexpression of 10 recombinant CYP BM3 variants in E. coli and of 8 recombinant human CYPS in yeast was attempted. Significant amounts of correctly folded protein were successfully generated for 6 CYP BM3 variants and their conversion activity towards several target TIAs was evaluated. TIAs tested included tabersonine, α-3’,4’-anhydrovinblastine and the vinblastine surrogate vindoline, in order to investigate if the BM3 variants have potential to be used for the engineering of the TIA pathway. Although the assay conditions need further optimization and the reaction products need characterization, the variant 2571 corresponding to BM3 9-10A F87V TS – 8C7 showed promising results. Several other variants also showed signs of potential affinity to α-3’,4’-anhydrovinblastine. Human CYPs revealed to be more difficult to be expressed with success and further optimization of the process is needed. Finally, it was possible to conclude that the CYP BM3 variants may be successfully expressed in plant cells and they assume a cytosolic localization in C. roseus leaf cells. This is relevant information for the design of future engineering strategies of C. roseus using CYP BM3s. Overall, this study generated important information and expertise for the future implementation of CYP based strategies for the improvement or diversification of the valuable TIA pathway from C. roseus through metabolic engineering.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/5602
Tipo de Documento: Dissertação de Mestrado
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