Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/5874
Title: Molecular markers of the healthy canine endometrial cycle
Authors: Santos, Celso Alexandre de Sá
Advisor: Carreira, Rita Maria Payan Martins Pinto
Santos, Dario Joaquim Simões Loureiro dos
Keywords: Gestação
Endométrio
Marcadores moleculares
Fertilidade
Cão
Ciclo do endométrio
Issue Date: 6-May-2016
Abstract: Após a puberdade, o endométrio canino encontra-se sujeito à influência da alternância dos esteróides sexuais que coordenam uma alternância cíclica de eventos que tem como objetivo último permitir a implantação do embrião e levar a gestação a termo. Ao longo do ciclo éstrico o endométrio sofre processos de remodelação intensos, que comportam proliferação, diferenciação, apoptose e regeneração, que são frequentemente agrupados sob a designação geral de “ciclo do endométrio”. Estes processos refletem a atividade cíclica de inúmeras moléculas com atuação local, autócrina e parácrina, coordenada através dos recetores para os esteróides sexuais. Em contraste com o que se observa noutras espécies, ainda existe pouca informação sobre as alterações cíclicas de marcadores moleculares ao longo do ciclo do endométrio em cadela, apesar do seu interesse potencial para a avaliação da fertilidade ou para a compreensão da patogénese de doenças endometriais. Deste modo, acreditamos que o trabalho aqui apresentado possa contribuir para elucidar alguns aspetos da fisiologia do endométrio canino. O trabalho apresentado neste documento inclui a avaliação das alterações da endopeptidase neutra (NEP)/CD10 no endométrio cíclico normal, assim como no início da gestação. A CD10 é uma endopeptidase neutra transmembranar geralmente utilizada em seres humanos para marcar o estroma endometrial normal. Contudo, esta enzima possui outras funções interessantes, incluindo a regulação da proliferação e diferenciação em muitos sistemas celulares. A imunolocalização de NEP/CD10 no endométrio de cadela revelou alterações cíclicas de todas as camadas do estroma, para além da existência de uma população de células negativas no estroma, subjacentes ao epitélio de superfície, e que partilham algumas caraterísticas morfológicas com as células predeciduais humanas. Por outro lado, a imunorreação observada para NEP/CD10 em amostras de gestação inicial sugere ainda um papel desta molécula na delimitação da invasão do embrião durante o processo de implantação. Outro aspeto importante na homeostase do endométrio é a integridade, coesão e polaridade que possuem as células epiteliais no útero, a qual é crítica para a fertilidade e a defesa contra infeções. No entanto, o epitélio deve também possuir a plasticidade necessária para participar nos processos cíclicos que ocorrem no endométrio, assim como permitir a interação entre o endométrio e o embrião durante a placentação. A adesão celular entre células epiteliais adjacentes é mantida pelos complexos caderina E/β-catenina. A identificação, pela técnica de imunohistoquímica, destas duas moléculas no endométrio canino, mostrou que existem variações cíclicas tanto ao nível do epitélio de superfície como glandular, sendo estas menos pronunciadas no epitélio glandular profundo em comparação com o epitélio glandular superficial ou o epitélio de superfície. Encontrou-se uma perda significativa de marcação no diestro inicial, refletindo uma diminuição da adesão intercelular, que poderá favorecer a interação do embrião com os tecidos maternos e a invasão do endométrio durante a implantação. A marcação das amostras utilizadas, que representam as fases de adesão no processo de implantação embrionária (dias 17 a 20), revela uma acentuada redução da marcação membranar no epitélio de superfície materno suportando a hipótese levantada. Além disso, no labirinto, as células deciduais gigantes não apresentaram marcação membranar para a caderina E ou para a β-catenina, enquanto o trofoblasto revela marcação membranar para estas duas moléculas. Por outro lado, verificou-se ainda neste trabalho que a β-catenina mostra variações no padrão de marcação citoplasmática durante o ciclo éstrico, especialmente no estro, em qualquer um dos epitélios analisados, sugerindo a ativação da via de sinalização Wnt/fator de crescimento Wg. A atividade cíclica normal das células do endométrio, bem como a sua renovação e remodelação, resulta na produção de espécies reativas de oxigénio (ROS), cuja acumulação pode comprometer a homeostase dos tecidos. Assim, as ROS são mantidas sob um controlo estrito por sistemas de defesa antioxidante nos quais se incluem as enzimas antioxidantes. As alterações neste equilíbrio têm sido associadas a infertilidade e ao desenvolvimento de doenças uterinas. Contudo, a informação disponível sobre enzimas antioxidantes e stresse oxidativo no endométrio canino é muito escassa. Num dos estudos apresentados agora, recorrendo à técnica da imunohistoquímica, caracterizou-se a distribuição, no endométrio canino, das células exprimindo duas importantes enzimas antioxidantes, a superóxido dismutase (SOD) e a glutationa-peroxidase (GPx). A marcação para a SOD apresentou variações cíclicas; em particular observou-se um aumento na sua proporção relativa nas fases sob influência da progesterona, em franco contraste com a GPx, que se revelou relativamente constante ao longo do ciclo. Em ambas as enzimas, a imunorreação do estroma foi sempre inferior à do epitélio. As espécies reativas de oxigénio encontram-se também sob o controlo de outras enzimas antioxidantes, como a catalase (CAT), a glutationa redutase (GSR) e a glutationa- S-transferase (GST). A atividade destas enzimas foi analisada ao longo do ciclo éstrico, sendo completada pela avaliação da peroxidação lipídica, através da medição de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), e ainda da oxidação de proteínas, através da quantificação de tióis (grupos sulfidrilo –SH totais). As enzimas glutationa-dependentes permaneceram relativamente constantes ao longo do ciclo, em oposição ao observado para a catalase, cuja actividade aumentou do anestro para o diestro, e para a SOD, cuja atividade apresentou um decréscimo do anestro para o diestro. Verificou-se ainda um ligeiro aumento da peroxidação lipídica no proestro, mas não se encontraram indícios de oxidação proteica. No seu conjunto, as alterações cíclicas verificadas demonstram um eficiente balanço oxidativo, sendo as variações registadas ao longo do ciclo éstrico, associadas às variações hormonais de estrogénio e de progesterona, e a vias de regulação do endométrio, de modo a manter uma adequada homeostase do endométrio. No global, este trabalho permitiu descrever as alterações na dispersão de algumas das moléculas que contribuem para a homeostase do endométrio nos cães, e também avaliar algumas das alterações que acompanham a interação do endométrio com o embrião, nas fases de gestação inicial, constituindo um ponto de partida para um conhecimento mais aprofundado da fisiologia e homeostasia do endométrio canino.
Starting at puberty, the canine endometrium is submitted to a cyclical coordinated sequence of events, in response to the influences of ovarian sex steroids; therefore several regulatory molecules show cyclic changes throughout the estrous cycle with the ultimate goal of allow embryos to implant and the pregnancy to proceed. Along the estrous cycle the endometrial tissue passes for different remodeling processes, encompassing proliferation, differentiation, apoptosis and regeneration that are often named as the “endometrial cycle”. Those processes reflect the activity of several molecules with autocrine and paracrine functions, which are coordinated through sex steroid receptors. Contrasting to other species, little information still exists concerning the cyclic changes of molecular markers during the canine endometrial cycle, despite their interest for prospecting female dog fertility or to the understand of pathogenesis of canine endometrial diseases. Thereby, we believe that the work presented in here will contribute to highligth some aspects of the physiology of the canine endometrium. The work presented in this document includes the assessment of the changes of neutral endopeptidase (NEP)/CD10 in the normal cyclic endometrium as well as in early pregnancy in dogs. CD10, a multifunctional transmembrane neutral endopeptidase, is usually used in humans to mark the normal endometrial stroma; however, this enzyme possesses other interesting functions, including the regulation of growth and differentiation in many cellular systems. The immunolocalization of NEP/CD10 in the canine endometrium revealed cyclic changes interesting all stromal layers, and also evidenced the existence of a negative stromal cell population underlying the superficial epithelium, which shared some morphological characteristics with the human predecidual cells. Moreover, the immunoreaction observed for NEP/CD10 in early pregnancy samples further suggests a role for this molecule in the process in limiting canine embryo invasion at implantation. An important aspect for the endometrial homeostasis respects the integrity, cohesion and polarity of the epithelial barriers in the uterus are critical for fertility and the defence against infection. Nevertheless, these must also present the necessary plasticity to participate in the cyclic processes occurring in the endometrium, as well as to accept the interaction with the embryo at placentation. Adherens junctions between adjacent epithelial cells are maintained by the E-cadherin/β-catenin complexes. These two molecules were immunolocalized in the canine endometrium, in both the superficial and glandular epithelia, displaying cyclic changes during the canine estrous cycle, which was less pronounced in the deep glandular epithelium. A softening of intercellular adhesion as found during early diestrus should favor embryo-maternal interactions and endometrial invasion during implantation. This hypothesis was supported by the marked reduction in the membrane immunoreaction expressed in the maternal surface epithelia compared to embryonic tissues, as observed in samples at pregnancy day 17 to 20. Moreover, in the labyrinth, giant decidual cells were devoid of membrane labeling for E-cadherin or β-catenin, in contrast to the membrane labeling evidenced in trophoblast cells. In addition, changes in the patterns of β-catenin cytoplasmic immunostaining were found during the cycle in both the surface and the glandular epithelia suggesting the activation of the Wnt/Wg growth factor signaling pathway, particularly in estrus. The normal activity of cells, as well as the cyclic cellular turnover or tissue remodeling often produces reactive oxygen species (ROS). Accumulation of these molecules may hamper tissue homeostasis; thereby ROS are maintained under tight control by scavenging system, which includes the antioxidant enzymes. Disturbance of this equilibrium has been associated to infertility and the development of uterine diseases. Still, limited information exists regarding antioxidant enzymes in the canine endometrium. In one experiment, superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), two important antioxidant enzymes, were localized in the canine endometrium using an immunohistochemistry approach. SOD distribution in canine endometrium showed cyclic variations, the progesterone-associated stages presenting the higher immuno-scores, in which contrasted to a relatively unchanged distribution of GPx1 distribution. In addition, for both the enzymes, the stromal immunoreaction was always lower than that of epithelia. ROS are controlled not only by SOD and GPx, but also by other antioxidant enzymes such as catalase (CAT), glutathione reductase (GSR) and glutathione-S-transferase (GST). The activity of these enzymes was evaluated throughout the estrous cycle along with lipid peroxidation and protein oxidation, by using thiobarbituric reactive species (TBARS) and total sulphydryls (-SH; thiols) analysis. Glutathione-dependent enzymes remained relatively unchanged during the cycle, contrasting with CAT, presenting increasing activity from anestrus upward, and SOD, which showed a decrease in the activity from anestrus to diestrus. There was only a slight increase in lipid peroxidation in proestrus with no protein oxidation verified once the thiol cell content remained always low. Collectively, cyclic changes registered showed an efficient oxidative balance, with variations along the estrous cycle being associated with steroid hormones fluctuations and with regulatory pathways of the endometrium, in order to maintain a proper endometrial homeostasy. Overall, the work presented herein allowed to assess the distribution and cyclic variations of particular molecular markers in the canine endometrium, as well as to study the changes they evidence during the interaction of the maternal tissues and the trophoblast during early pregnancy events. Therefore it brought some new information on the physiology and homeostasis of the canine endometrium.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias
URI: http://hdl.handle.net/10348/5874
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:TD - Teses de Doutoramento

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