Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/679
Title: Creation and characterization of mitochondrial dna-depleted human huntington’s disease and control derived lymphoblasts
Authors: Ribeiro, Maria João Rodrigues Ferreira
Advisor: Rego, Ana Cristina
Sílvia, Amélia
Keywords: Doença de Huntington
Huntingtina mutante
Disfunção mitocondrial
Células ρ0
Brometo de etídeo
Linfoblastos
Cadeia respiratória mitocondrial
Issue Date: 2010
Abstract: A doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante, caracterizada por perda neuronal selectiva dos neurónios do estriado e córtex. Os seus sintomas incluem movimentos corporais involuntários (nomeadamente coreia e distonia), alterações de personalidade, perda da habilidade cognitiva e demência. A sua causa deve-se à presença de expansões trinucleótidicas CAG no gene IT15 ou HD que, neste caso, codifica uma proteína com um número de poliglutaminas, aumentado, a huntingtina mutante (mHtt). A mHtt interfere directa ou indirectamente em vários mecanismos inerentes à doença, incluindo a disfunção mitocondrial. Sabe-se que a presença de mHtt provoca um decréscimo na capacidade de tamponização do Ca2+, no potencial de membrana (ΔΨm), na actividade do complexo II, aumento de espécies reactivas de oxigénio (ROS), tráfego anormal de vesículas e alteração da dinâmica mitocondrial, o que culmina em morte neuronal. No entanto, desconhece-se a causa específica e a natureza da disfunção mitocondrial, associada à degeneração selectiva, presente na doença de Huntington. Nós últimos anos vários modelos, têm vindo a ser desenvolvidos, nomeadamente a criação de células rho zero (ρo), com intuito de avaliar a disfunção mitocondrial, assim como defeitos bioenergéticos característicos da doença de Huntington. O brometo etídeo (EtBr), é um agente que se intercala no DNA, que quando presente em concentrações baixas, inibe a replicação do mtDNA, sem afectar o nDNA, sendo, portanto, amplamente utilizado na obtenção de células ρo. Este trabalho teve como principal objectivo, criar e caracterizar células ρo a partir de linfoblastos controlo (CTR) ou doentes (HD). Neste trabalho as linhas de linfoblastos CTR ou HD foram incubadas com concentrações definidas de EtBr, 25 e 50 ng/ml durante 15 ou 30 dias, sendo posteriormente analisada a actividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial, assim como a expressão de subunidades dos complexos I, II e IV. Os nossos resultados demonstram que a exposição a 25 e/ou 50 ng/ml de EtBr promove uma diminuição significativa na expressão da subunidade 20 kDa do Cx I e uma redução moderada na expressão da subunidade 57 kDa do Cx IV, ambas codificadas pelo mtDNA. Estas alterações são acompanhadas, pelo decréscimo da actividade do Cx I e do Cx IV. Em contraste, a expressão da subunidade 30 kDa do Cx I e da subunidade 70 kDa do Cx II ambas codificadas pelo nDNA, não são afectadas. No entanto, 60 dias após a remoção de EtBr, ocorre uma recuperação da expressão das subunidades 20 kDa do Cx I e 57 kDa do Cx IV, ambas codificas pelo mtDNA, aumentam. Verificamos também que a expressão da Hsp60, uma proteína mitocondrial codificada pelo nDNA, permanece inalterada, após tratamento com EtBr, tanto em linfoblastos CTR como HD. Os resultados obtidos com este trabalho indicam que a exposição a concentrações definidas de EtBr inibe selectivamente a replicação do mtDNA, sem afectar o nDNA, fornecendo evidências para a possibilidade de criação de células ρo CTR e HD a partir de linfoblastos humanos.
Huntington disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disease characterized essentially by selective neuronal loss of neurons in the striatum. Symptoms include involuntary body movements (e.g chorea and dystonia), personality changes, loss of cognitive ability, leading to dementia. HD is caused by the presence of trinucleotide CAG expansion in IT15 gene or HD gene, which encodes a protein with an increased number of polyglutamines, namely mutant huntingtin (mHtt). mHtt interferes directly or indirectly in various mechanisms of disease, including mitochondrial dysfunction. It is know that presence of mHtt cause a decrease in Ca2+ buffering capacity, decrease in mitochondrial membrane potential (ΔΨm), defective bioenergetics, decrease of complex II activity, increase generation of reactive oxygen species (ROS), induce abnormal traffic of vesicles and impairment in mitochondrial dynamics, leading to neuronal death. However, the precise nature and cause underling mitochondrial dysfunction selective degeneration in HD is still unknown. In the last years, several models have been developed, including rho zero cells (ρo), to evaluation of mitochondrial dysfunction and bioenergetics defects that play an important role in HD. Ethidim bromide (EtBr) is the most frequent DNA intercalating agent used, which in low concentrations, inhibits mtDNA without affecting nDNA. In the present work CTR or HD lymphoblast cell lines were cultured in the presence of 25 and 50 ng/ml EtBr for 15 or 30 days, and further assayed for mitochondrial respiratory chain (MCR) complexes activities and associated subunits expression of complexes I, II and IV by western blotting analysis. However, 60 days after EtBr withdrawal, recovery in mtDNA-encoded Cx I 20 kDa and Cx IV 57 kDa subunits was observed. In addition we observed the expression of Hsp60. A mitochondrial protein encoded by nDNA, remains unchanged, that after treatment with EtBr. These data indicate that exposure to defined concentrations of EtBr, selectively inhibits the replication of mtDNA without affecting nDNA, providing evidence for the possible creation of ρo cells from CTR or HD human lymphoblasts.
Description: Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciência da Saúde
URI: http://hdl.handle.net/10348/679
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:OLD - Dissertações de Mestrado

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