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Title: Role of mitochondrial p66Shc in nefazodone-induced mitochondrial toxicity on HepG2 cells
Authors: Silva, Ana Marta Ribeiro da
Advisor: Oliveira, Paulo
Santos, Dario
Keywords: Apoptose
Carcinoma hepatocelular (humano)
Hepatotoxicidade
Linha celular
Nefazodona
Issue Date: 2015
Abstract: A Nefazodona (NEF) é um fármaco antidepressivo, usado durante um longo período no tratamento da depressão. Apesar da sua eficácia, este fármaco foi retirado do mercado devido ao aparecimento de diversos casos de lesão hepática em pacientes submetidos a tratamento com NEF. A via de sinalização celular que envolve a proteína p66Shc, e a sua fosforilação na serina 36 (Ser36) após estimulo de stress, foi anteriormente associada à produção de espécies reactivas de oxigénio e à ocorrência de morte celular. De acordo com esta hipótese, a proteína p66Shc é translocada para a mitocôndria após uma situação de stress celular onde participa na produção de ROS, levando ao comprometimento da função mitocondrial e podendo, ainda, desencadear o processo de morte celular. O principal objectivo deste trabalho foi investigar a possibilidade de que esta via de sinalização seja activada na linha celular do carcinoma hepatocelular humano (HepG2) durante o tratamento com NEF. Os resultados obtidos revelaram um aumento do teor de p66Shc em células expostas à nefazodona por um perídodo de 72 h e ainda um surpeendente decréscimo da forma fosforilada desta proteína após o tratamento com NEF. Embora este trabalho não possa comprovar a existência de uma ligação entre a administração de NEF e a activação e translocação da proteína p66Shc, os resultados obtidos corroboram a existência de uma associação entre o tratamento com NEF e o início do processo apoptótico no modelo celular utilizado. O tratamento com NEF levou à diminuição da massa celular, à despolarização mitocondrial e ainda a alterações na morfologia celular, com as células HepG2 a exibirem caracteristicas tipicamente encontradas em células apoptóticas. Foram também encontradas outras evidências consistentes com a activação da apoptose induzida por NEF, como o aumento da população de células apoptóticas, a diminuição da população de células viáveis e o aumento da actividade das caspases. Em suma, os resultados obtidos mostram um aumento dos níveis de ROS após o tratamento com NEF, embora a possibilidade de uma associação entre este aumento e a activação da p66Shc e translocação para a mitocôndria possa estar ocultada devido ao rápido processamento da forma fosforilada da proteína p66Shc.
Nefazodone (NEF) is an antidepressive agent that has been used for several years in the treatment of depression. Despite its efficacy in the treatment of depression, NEF was withdrawn from the market after the development of hepatic injury on several patients upon treatment. p66Shc signalling, which implicates its phosphorylation in ser36 residue (pSer36-p66Shc) upon stress stimuli, has been described to be involved on reactive oxygen species (ROS) generation and cell death. After its phosphorylation p66Shc is thought to be translocated to mitochondria where it leads to further ROS production, disrupting mitochondrial function and possibly triggering of cell death. The main objective of the present work was to investigate whether p66Shc signalling is activated during NEF treatment of a human hepatocellular cell line (HepG2). Our results revealed an increase on p66Shc content after 72 h of incubation with NEF, whereas, surprisingly the content of p66Shc phosphorylated form was decreased after NEF treatment. Although this study was not able to prove the existence of a link between NEF administration and p66Shc activation and consequent translocation to mitochondria, our results support the existence of a link between NEF treatment and apoptosis in the hepatic cell model. NEF treatment led to a decrease in cell mass, mitochondria depolarization and to changes on HepG2 cell morphology, which showed features typical from apoptotic cells. We also found other evidences supporting apoptosis activation upon Nefazodone treatment, such as the increase on late apoptotic cell population, the decrease on viable/early apoptotic cells and an increase of caspases activity. In summary, our data showed an increase of ROS levels upon NEF treatment which although might be associated with p66Shc signaling and its consequent translocation to mitochondria, the fast turn-over of pSer36-p66Shc may be masking these observations.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia
URI: http://hdl.handle.net/10348/6943
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:DEBA - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

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