Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/7027
Title: Pesquisa de biocompostos em Boletus edulis e Boletus pinophilus com ação anticancerígena
Authors: Alves, Maria Helena Araújo Portugal de Guichard
Advisor: Marques, Guilhermina Miguel da Silva
Nunes, Fernando Hermínio Ferreira Milheiro
Keywords: Cogumelos
Boletus
Biomoléculas
Glícidos
Melanina
Ácidos nucleicos
Ribose
ARN
Issue Date: 2014
Abstract: Os cogumelos para além do seu valor gastronómico e nutricional são uma fonte de compostos com atividades biofuncionais reconhecidas desde há cerca de 5000 anos e confirmadas com testes in vitro e ensaios in vivo nas últimas duas gerações. Entre essas actividades biológicas destaca-se a atividade antitumoral e imunoestimulante cuja pesquisa se intensificou desde os anos 90. Estudos prévios demonstraram a existência de biopolímeros, extraídos com água quente, de um extrato de Boletus edulis com atividade anticancerígena, onde se destacava a fração,extraída, denominada BE3. O objetivo deste trabalho foi determinar a natureza química desta fração com elevado potencial anticancerígeno. Foi, também, objetivo desta pesquisa, verificar se outros cogumelos do mesmo género continham este biocomposto e em caso afirmativo testar o seu potencial anticancerígeno. Para tal utilizou-se como matéria-prima a película dos carpóforos dos cogumelos Boletus edulis e Boletus pinophillus. Os biopolímeros foram obtidos por tratamento do material com etanol a 80%, a quente, de forma a obter o resíduo insolúvel em álcool (AIR). O AIR foi fervido em água, concentrado e dializado (MWcut 12-14 kDa). A fracção BE3 e também a correspondente fração para Boletus pinophilus (BP3) foram isoladas por cromatografia de troca aniónica com eluição do material retido com solução aquosa de NaCl de 0,25 a 0,5M. Efetuou-se também a pesquisa de eumelaninas solúveis nos extratos de Boletus edulis e Boletus pinophilus, nas frações BE3 e BP3, não tendo sido detetadas quantidades significativas deste biopolímero. Para tal foi foi extraída a melanina da tinta de Sepia officinalis sofrendo clivagem oxidativa e identificados, de seguida, os monómeros, em HPLC.Para verificar a validade do método de clivagem oxidativa, em meio alcalino, da eumelanina em monómeros de PDCA e PTCA, testou-se no sistema cromatográfico a detecção e identificação de PDCA e PTCA da eumelanina da Sepia officinalis em HPLC. Os padrões puros de PDCA e PTCA que foram fornecidos por laboratório do Japão foram testados também no sistema cromatográfico. Fez-se a separação dos extratos HWBE e HWBP em diferentes frações (1,2,3,4,e5) por cromatografia de troca aniónica com eluição com solução de NaCl a concentrações crescentes. Pesquisou-se também o conteúdo qualitativo e quantitativo das amostras em monossacarídeos pela análise em HPLC, com prévia hidrólise ácida em: extrato inicial de BE e BP, HWBE e HWBP e de BE3 e BP3.Procedeu-se também a análise colorimétrica ácido fenólica de açúcares, em espectrofotometria, a 490nm. A análise quantitativa de açúcares foi feita, com recurso ao método da análise cromatográfica em HPLC,pelo método do padrão interno utilizando-se o cálculo de regressão linear dos mínimos quadrados. Todos estes métodos permitiram chegar ao teor quanto ao conteúdo (quantitativo e qualitativo) de monossacarídeos, dos extratos: inicial de BE e BP, de H WBE e HWBP e de BE3 e BP3. Verificou-se então que as frações BE3 e BP3, para além de baixo teor de açúcares já identificados em (Cardoso,2012),continham quantidades significativas de ribose, o que sugeria a presença de ARN. A pesquisa de ARN foi confirmada no nosso sistema cromatográfico pela deteção de um pico muito semelhante ao libertado pelo do padrão puro de ribose, (e não de padrão de desoxirribose), introduzido no HPLC.O espectro de ultravioleta visível obtido para estas frações foi um espetro típico de ácidos nucleicos: absorvância máxima a 260nm em UV-Vis. O tratamento destas frações com DNAse e a análise por eletroforese em gel de agarose com coloração de brometo de etídio, permitiu a identificação de uma banda para cada uma das amostras BE3 e BP3, inferior a 100 pares de bases, característica e identificativa de ácidos nucleicos. Também a anterior identificação de açúcar maioritário, nos extratos, como sendo a ribose e não a desoxirribose, aliado ao fato do tratamento destas frações com transcriptase reversa permitir a síntese do cDNA, confirmou a natureza de ARN nas amostras dos Boletus. No entanto na análise da atividade anticancerígena, avaliada pela inibição da proliferação celular HT29,a fração BP3 não apresentou uma atividade significativa no teste BRdU, contrariamente à fração isolada de Boletus edulis (BE3) e a de Boletus spretus (BS4) que registaram valores de eficácia da ordem dos 90% e 85%. Este facto sugere que para a atividade biológica do ARN destes Boletus, a composição e/ou a conformação da biomolécula serão determinantes para a sua atividade anticancerígena.
Beyond their culinary and nutritional values, mushrooms are also a source of compounds with biofunctional activities, recognized for nearly 5000 years and confirmed by in vitro and in vivo tests during the last two generations. Among these biological activities we highlight the antitumor and immunostimulatory activities whose research has been intensified since the 1990s. Previous studies have demonstrated the existence of biopolymers, extracted with hot water from a Boletus edulis extract, with anticancer activity, among which we highlight the extracted fraction called BE3. The objective of this study was to determine the chemical nature of this fraction with high anticancer potential. This study also aimed to verify if this same biocompound can also be found in other mushrooms and, if so, to test its anticancer potential. For this purpose we used as raw material the film fruiting bodies of Boletus edulis and Boletus pinophillus mushrooms. The biopolymers were obtained by treating the material with 80% ethanol, at hot, to obtain the alcohol insoluble residue (AIR). The AIR was boiled in water, dialyzed and concentrated (MWcut 12-14 kDa). The fraction BE3 and also the fraction corresponding to Boletus pinophilus (BP3) were isolated by anion exchange chromatography with elution of the material retained with NaCl 25-0,5 M solution. The search for soluble eumelanins in Boletus edulis and Boletus pinophilus extracts, in BE3 and BP3 fractions, was also carried out, but no significant amounts of this biopolymer were found. To perform this research, the melanin was extracted from the ink of Sepia officinalis undergoing oxidative cleavage and then the monomers were identified by HPLC analysis. To verify the validity of the oxidative cleavage method, in an alkaline medium, for the eumelanin monomer PDCA and PTCA, we tested in the chromatographic system the detection and identification of eumelanin PTCA and PDCA Sepia officinalis by HPLC. The pure PDCA and PTCA standards that were provided by Japanese laboratories were also tested in the chromatographic system. The separation of the HWBE and HWBP extracts into different fractions (1, 2, 3, 4 e5) by anion exchange chromatography with elution with NaCl solution at increasing concentrations, has also been done. It is also researched the qualitative and quantitative content of samples into monosaccharides by HPLC analysis, with prior acid hydrolysis: the initial extract BE and BP, and HWBE HWBP and BE3 and BP3. The phenolic acids colorimetric analysis of sugars, in spectrophotometry at 490nm, has also been performed. The quantitative analysis of sugars was made, using the method of chromatographic analysis on HPLC, by the internal standard method using the method of linear regression least squares. All these methods have resulted on the determination of the monosaccharides content (quantitative and qualitative) in the extracts: initials BE and BP, HWBE and HWBP and BE3 and BP3. It has been found that the BE3 and BP3 fractions, as well, has low quantity sugars that have been identified in (Cardoso, 2012), they also contained significant amounts of ribose, suggesting the presence of RNA. The RNA research was confirmed in our chromatographic system for the detection of a very similar peak to off by the pure ribose default (not deoxyribose default), introduced in HPLC.The visible ultraviolet spectrum obtained for these fractions was typical for nucleic acids: maximum absorbance at 260nm UV-Vis. The treatment of these fractions with DNase and analysis by agarose gel electrophoresis, with ethidium bromide staining, led to the identification of a band for each of the samples BE3 and BP3, less than 100 base pairs, which is characteristic and identifier of nucleic acids. Also the previous identification of majority sugar in the extracts as ribose (instead of deoxyribose) together with the fact that the treatment of these fractions with reverse transcriptase allows cDNA synthesis, attested the RNA nature in the Boletus samples. However in the analysis of anticancer activity, as assessed by inhibition of HT29 cell proliferation, the BP3 fraction showed no significant activity in test BrdU, unlike the isolated fraction Boletus edulis (BE3) and the Boletus spretus (BS4) that registered values of effectiveness of the order of 90% and 85%. This suggests that for the biological activity of this RNA Boletus, the composition and / or conformation of the biomolecule will determine their anticancer activity.
Description: Dissertação de Mestrado em Biologia
URI: http://hdl.handle.net/10348/7027
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:DEBA - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

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