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Título: Genome-wide phenotypic analysis of Saccharomyces cerevisiae in response to chitosan
Autor: Lemos, Ana Isabel Alves
Orientador: Ferreira, Alexandra Mendes
Lage, Patrícia
Palavras-chave: Quitosana
Saccharomyces cerevisiae
Quimiogenómica
Vinho
Leveduras contaminantes
Data: 6-Fev-2017
Resumo: O SO2 tem sido amplamente utilizado na indústria vínica, não apenas como agente antioxidante e antioxidásico, mas mais importante, devido às suas propriedades antimicrobianas. A ocorrência de leveduras de contaminação que podem tolerar altas concentrações de SO2 tem levado ao uso de níveis perto do limite legal estabelecido pela legislação da União Europeia, constituindo uma ameaça à saúde humana. Assim, existe um grande interesse na procura de outros conservantes mais seguros para substituir ou apenas reduzir a utilização de SO2 como um agente antimicrobiano. A quitosana, um biopolímero natural não-tóxico, tem sido sugerida como um potencial agente útil na conservação de alimentos, devido às suas propriedades biológicas, tais como a sua atividade antimicrobiana. A adição de quitosana, até a um limite de 0.1 g/L foi aceite desde julho de 2009 pelo Codex Enológico Internacional como uma nova prática enológica, como agente de clarificação do vinho. Além disso, é também reconhecida a sua eficácia para eliminar microrganismos de contaminação, tais como leveduras, nomeadamente Dekkera/ Brettanomyces spp. Tanto o modo de ação da quitosana como os mecanismos de resistência da levedura são ainda pouco compreendidos e sujeitos a debate. Na tentativa de contribuir para o esclarecimento destas questões, neste trabalho foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo. Assim, a coleção de mutantes haploides de S. cerevisiae deletados de genes individuais foi utilizada para identificar novos genes/vias importantes envolvidas na resistência da levedura a este antimicrobiano. Neste estudo, a concentração máxima de quitosana permitida para uso enológico não teve um efeito fungicida sobre a estirpe parental Saccharomyces cerevisiae BY4741. A utilização de uma gama de concentrações de quitosana (0.25 - 1.0 g/L) permitiu a dentificação de 252 genes cuja deleção conduz a um fenótipo de hipersensibilidade à quitosana e 207 genes cuja deleção conferiu resistência, dos quais 29 mutantes foram classificados como hiper-resistentes. A distribuição funcional dos genes cuja deleção conferiu hipersensibilidade à quitosana, inclui Proteínas ribossomais, Ciclo celular e processamento de DNA, Regulação do metabolismo de compostos de carbono e aminoácidos, Parede celular, Metabolismo dos fosfolípidos, Transporte vacuolar/lisossomal e Transcrição. Por outro lado, categorias funcionais como Transporte intracelular (Peroxissoma, Retículo endolasmatico e Golgi), Homeostasia iónica, Modificação de proteínas e Envelhecimento celular foram as mais representativas entre os genes cuja ausência conduziu a um fenótipo de resistência. Estas descobertas elucidam a base molecular da toxicidade da quitosana e serão úteis para pesquisas futuras sobre a aplicação da quitosana como um agente antimicrobiano eficaz e seguro não só no vinho, mas também noutras indústrias de alimentos.
In wine industry SO2 has been widely used not only as an antioxidant and antioxidasic agent, but most importantly, due to its antimicrobial proprieties. The occurrence of spoilage yeasts that can tolerate high concentrations of SO2 requires the use of levels near the European Union legal limit, constituting a threat to human health. Thus, there has been a great interest in looking for safer preservatives to replace or at least reduce the use of SO2 as an antimicrobial agent. Chitosan, a natural nontoxic biopolymer, has been proposed as potential useful agent in food preservation due to their biological activities, such as antimicrobial activity. Chitosan addition, up to 0.1 g/L, has been accepted as a new oenological practice since July 2009 by the International Oenological Codex as a fining agent of wine. Additionally, it has been recognized its effectiveness in the control of the spoilage yeast such as Dekkera/Brettanomyces spp. Both the mode of action of chitosan and mechanisms of resistance in yeast are still poorly understood and subject to debate. In an effort to contribute to the elucidation of these questions, in this work we used the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model. In this way, a genome-wide screen for altered susceptibility to chitosan was performed using the EUROSCARF haploid yeast deletion collection in order to identify new genes/pathways relevant in yeast resistance to this antimicrobial agent. In this study, we found that the maximum permissible concentration of chitosan for oenological use had no fungicide effect on the parental strain Saccharomyces cerevisiae BY4741. The use of a range of chitosan concentrations (0.25 - 1.0 g/L) allowed the identification of 252 genes whose deletion caused hypersensitivity to chitosan and 207 genes whose deletion conferred chitosan resistance, of which 29 mutants were classified as hyper resistant. Functional categories overrepresented with genes whose absence renders cells hypersensitivity to chitosan mainly include ribosomal proteins, cell cycle and DNA processing, regulation of C-compound and amino acid metabolism, cell wall, phospholipids metabolism, vacuolar/lysosomal transport and transcription. On the other hand, functional categories, such as intracellular transport routes (peroxisome, endoplasmatic reticulum and Golgi), ionic homeostasis, protein modification and cell aging, were overrepresented among the genes whose absence rendered mutants resistance. These findings shed light on the molecular basis of chitosan toxicity and will be helpful for future research on the application of chitosan as an effective and safer antimicrobial agent not only in wine, but also in other food industries.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Biotecnologia e Qualidade Alimentar
URI: http://hdl.handle.net/10348/7248
Tipo de Documento: Dissertação de Mestrado
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