Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/7555
Título: An «omic» approach to characterize antibiotic resistance of Salmonella spp.: impacts in food safety and public health
Autor: Correia, Susana Apolinário
Orientador: Igrejas, Gilberto Paulo Peixoto
Poeta, Patrícia Alexandra Curado Quintas Dinis
Capelo Martínez, José Luis
Palavras-chave: Resistência microbiana a medicamentos
Antimicrobiano
Salmonella Typhimurium
Proteínas de bactérias
Quinolonas
Ciprofloxacina
Proteoma
Data: 2017
Resumo: A resistência aos antimicrobianos representa uma ameaça séria e actual à saúde pública mundial e estirpes multirresistentes de Salmonella enterica subsp. enterica serotipo Typhimurium e fagotipo DT104B com resistência adicional às quinolonas têm sido responsáveis por surtos globais e elevada mortalidade. Devido ao elevado impacto das infecções por Salmonella não tifóide e à vital importância dos antibióticos da classe das fluoroquinolonas, a resistência às fluoroquinolonas em Salmonella não tifóide é considerada uma situação de elevada preocupação a nível internacional. Apesar de ser do conhecimento geral que a resistência às fluoroquinolonas é multifactorial, ainda se desconhecem muitos dos elementos que contribuem para este fenótipo. A proteómica tem progredido significativamente no que respeita à caracterização de proteínas envolvidas em mecanismos de resistência, tendo contribuído amplamente para o conhecimento actual dos efeitos das redes metabólicas na antibiorresistência assim como na identificação de novos alvos. De modo a contribuir com novas perspectivas sobre os mecanismos de resistência envolvidos, três estirpes clínicas clonalmente relacionadas de Salmonella Typhimurium DT104B com fenótipos de resistência distintos, Se6, Se20 e Se6-M, foram exaustivamente estudadas através de diferentes abordagens proteómicas, complementadas com métodos genómicos e transcriptómicos. Numa análise preliminar, o proteoma total da estirpe Se20, que adquiriu resistência às quinolonas in vivo após tratamento do paciente com ciprofloxacina, tal como o proteoma total da estirpe de referência SL1344, foram determinados por 2-DE~MALDI-TOF MS. Um total de 178 e 202 spots proteicos (representando 143 e 166 produtos de genes específicos) foram identificados, respectivamente, nas estirpes Se20 e SL1344, fornecendo uma visão global da expressão proteica destas estirpes em condições normais de crescimento. Subsequentemente, com o intuito de detectar proteínas diferencialmente expressas relacionadas com mecanismos de resistência, foram realizadas várias análises subproteómicas comparativas, combinando identificação por 2-DE~LC-MS/MS e shotgun LC-MS/MS para análise do subproteoma intracelular e membranar, respectivamente. Numa primeira instância, a estirpe Se20, seleccionada in vivo, foi comparada à estirpe Se6-M, um mutante altamente resistente seleccionado in vitro a partir da estirpe parental da Se20 (Se6) por passagens sucessivas em concentrações crescentes de ciprofloxacina. Um total de 50 e 7 proteínas (32+2 mais abundantes em Se20 e 18+5 mais abundantes em Se6-M) foram identificadas nos subproteomas intracelular e membranar, respectivamente. Posteriormente, cada estirpe resistente, Se20 e Se6-M, foi comparada individualmente ao nível subproteómico com a estirpe parental, Se6, e também sob stress com ciprofloxacina. No total, foram identificadas 14 proteínas diferencialmente expressas ao comparar as estirpes Se6 e Se20 e 91 proteínas ao comparar a estirpe Se20 com Se20+CIP. Um total de 35 proteínas diferencialmente expressas foram identificadas na comparação das estirpes Se6 e Se6-M e 82 foram identificadas entre Se6-M e Se6-M+CIP. Em conjunto, ambas as condições de stress revelaram um total de 125 proteínas relacionadas com a resposta à ciprofloxacina, das quais apenas 45 são comuns a ambas as estirpes. Das restantes, 45 e 38 foram identificadas exclusivamente nas estirpes Se20 e Se6-M, respectivamente, salientando a importância de incluir tanto estirpes adaptadas em laboratório como estirpes adaptadas clinicamente neste tipo de abordagens comparativas. O papel das proteínas identificadas como determinantes de resistência é discutido nos contextos do influxo reduzido de antibióticos através da diminuição da expressão de porinas e de alterações na organização e integridade da membrana externa através de modificações de LPS, lipoproteínas ou peptidoglicano. Adicionalmente, é também discutido o papel de importadores ABC, de reguladores metabólicos e dos mecanismos bacterianos de resposta ao stress, quer como determinantes de resistência ou alvos para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos. O elevado número de proteínas identificadas neste estudo constitui informação valiosa sobre a expressão diferencial de proteínas envolvidas em mecanismos de resistência, fornecendo novas evidências sobre a natureza dos distúrbios fisiológicos causados pelo antibiótico. Tal pode conduzir à formulação de novas hipóteses no que respeita não só ao mecanismo de acção das fluoroquinolonas, mas também a proteínas-alvo secundárias implicadas em mecanismos adaptativos e compensatórios. Os resultados obtidos salientam ainda que o uso coordenado de técnicas proteómicas e bioinfomáticas de alto rendimento, complementadas com diferentes métodos genómicos e transcriptómicos, possibilitam uma melhor detecção dos múltiplos mecanismos envolvidos na aquisição de resistência. As vias envolvidas na aquisição de resistência, realçadas nas diversas abordagens realizadas neste estudo, podem ser úteis não só para prolongar o uso dos antibióticos actuais, como também para o desenvolvimento de novos antibióticos e estratégias alternativas para combater a emergência e disseminação de resistência no agente patogénico de origem alimentar de elevado impacto na saúde humana, Salmonella Typhimurium DT104B.
Antimicrobial resistance is a worldwide public health threat and Salmonella enterica subsp. enterica serotype Typhimurium phage type DT104B multiresistant strains with additional quinolone resistance have been responsible for global outbreaks and high mortality. Due to the worldwide high human health impact of nontyphoidal Salmonella infections and vital importance of the fluoroquinolone class of antibiotics, fluoroquinolone-resistance in nontyphoidal Salmonella is considered a situation of serious and international concern. Fluoroquinolone resistance is known to be multifactorial but is still far from a complete understanding. Proteomics achieved significant progress in the characterization of proteins involved in resistance mechanisms and have greatly contributed to the understanding of the effect of metabolic networks on antibiotic resistance and to identify new drug targets. Hence, in order to give new insights about the resistance mechanisms involved, three clonally related Salmonella Typhimurium DT104B clinical strains with different antimicrobial resistance phenotypes, Se6, Se20 and Se6-M, were thoroughly studied through different proteomic approaches complemented with genomic and transcriptomic methods. In a preliminary analysis, the complete proteome of the Se20 strain, which acquired quinolone resistance in vivo after patient treatment with ciprofloxacin, was determined by 2-DE~MALDI-TOF MS together with the total proteome of reference strain SL1344, in order to obtain an overview of global protein expression under normal growth conditions. A total of 178 and 202 protein spots (representing 143 and 166 unique gene products) were positively identified, respectively, in Se20 and SL1344, providing a snapshot of the major proteins involved in the basic cellular physiology of these strains. Subsequently, in order to specifically observe mechanism-related differential protein expression, a set of different comparative subproteomic analyses were performed by combining 2-DE~LC-MS/MS and shotgun LC-MS/MS identification approaches for intracellular and membrane subproteomes, respectively. First, the in vivo selected Se20 strain was compared to Se6-M, an in vitro selected highly resistant mutant, obtained from the parental strain of Se20 (Se6) by laboratory evolution with increasing ciprofloxacin concentrations. A total of 50 and 7 unique proteins (32+2 more abundant in Se20 and 18+5 more abundant in Se6-M) were identified in the intracellular and membrane subproteomes respectively. Afterwards, each of the quinolone-resistant strains, Se20 and Se6-M, were individually compared at the subproteomic level with their parental strain Se6 and also under ciprofloxacin stress. In total, 14 differentially abundant proteins were identified when comparing Se6 with Se20 and 91 were identified between Se20 and Se20+CIP. A total of 35 differentially abundant proteins were identified when comparing Se6 with Se6‑M and 82 were identified between Se6‑M and Se6‑M+CIP. Both stress conditions together revealed a total of 125 unique antibiotic-stress response proteins, of which only 45 were common to the two strains. Of the remaining, 45 and 38 stress response proteins were exclusively identified in Se20 and Se6-M respectively, highlighting the importance of including both laboratoryand clinically-adapted strains in these comprehensive comparative approaches. The roles of the identified proteins as resistance determinants is discussed in the contexts of reduced diffusion-mediated antibiotic uptake through porin downregulation and alterations in bacterial outer membrane organization and integrity through LPS, lipoprotein and peptidoglycan modifications. Additionally, the roles of identified ABC importers, global regulators of bacterial metabolism and bacterial stress response mechanisms as either determinants of antimicrobial resistance or targets for the development of new antimicrobial drugs is also discussed. The great number of proteins identified in the different comparative approaches provide valuable information about mechanism-related differential protein expression, giving new evidences on the nature of the physiological disturbance caused by the antibiotic, which might lead to new testable hypotheses on the mode of action of fluoroquinolone drugs and also secondary target proteins implicated in adaptation and compensatory mechanisms. Also, the results obtained emphasize that an improved detection of the multiple and superposing mechanisms that are usually involved in resistance acquisition can be achieved through the coordinated use of high-throughput proteomics and bioinformatics techniques complemented with different genomics and transcriptomics methods. By highlighting pathways involved in the acquisition of resistance, the comprehensive approaches performed in this study may be helpful not only to extend the useful life of current antimicrobials but also to develop new drugs and strategies to combat the emergence and spread of resistance in the high human health impact foodborne pathogen Salmonella Typhimurium DT104B.
Descrição: Tese de Doutoramento em Genética Molecular, Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/7555
Tipo de Documento: Tese de Doutoramento
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