Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/7835
Title: SNP detection in F3H gene of Vitis vinifera L. for varietal identification using HRM and biosensors
Authors: Castro, Cláudia Manuela Oliveira
Advisor: Lopes, Paula Filomena Martins
Gomes, Sónia Maria Alves
Keywords: Vitis vinifera
Polimorfismo de núcleótido único
Antocianimas
Fusão de alta resolução
Biossensores de DNA
Issue Date: 2015
Abstract: Vitis vinifera L. é a principal espécie utilizada para a produção de fruta no mundo, sendo cultivada em aproximadamente 90 países. Em 2014, a produção mundial de uva foi estimada em 737 Mqx. Mundialmente, existem aproximadamente 5,000 variedades de videira, o que representa uma grande variabilidade genética. Em Portugal, existem 343 variedades que podem ser utilizadas na produção de vinho, sendo que 240 são possivelmente autóctones. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) é a alteração mais pequena do genoma e representa a forma mais básica e abundante de variação genética, sendo adequados para a discriminação varietal. Vários métodos têm sido desenvolvidos para detetar os SNPs. O objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologias baseadas em DNA adequadas à deteção de variações de SNP em V. vinifera, que permitam a discriminação varietal. A deteção de SNPs foi realizada utilizando um gene pertencente à via biossintetica das antocianinas, o flavanone 3-hydroxylase (F3H, EC: 1.14.11.9), que foi sequenciado em 21 variedades de V. vinifera. Os SNPs detetados permitiram a conceção de dois ensaios de High Resolution Melting e o desenho de duas sondas, com diferentes comprimentos, para um biossensor baseado numa fibra ótica com long period grating. Foram identificados 12 SNPs no gene F3H por sequenciação, permitindo a discriminação de um total de 5 das 21 variedades de videira. Os dois ensaios desenvolvidos para High Resolution Melting permitiram a discriminação de duas variedades: Tinta Roriz e Moscatel Galego. As outras variedades foram agrupadas de acordo com os dados da sequenciação. O biossensor detetou uma diferença de apenas um SNP, mesmo com amostras de DNA genómico, onde mecanismos de competição estão presentes. O comprimento da sonda utilizada influenciou a deteção dos alvos sintéticos, tendo um comportamento inconsistente quando foi utilizada a sonda maior, com 35 bases. No entanto, quando o DNA genómico foi utilizado na plataforma, este efeito desapareceu, sendo capaz de produzir um deslocamento estatisticamente significativo, típico do processo de hibridação. Este sensor é altamente sensível e específico, não necessitando de marcação, não respondendo às interferências eletromagnéticas, permitindo obter medições em tempo real e sendo reutilizável. Duas plataformas diferentes foram desenvolvidas com sucesso para a identificação de variedades de videira com base na sequência do gene F3H.
Vitis vinifera L. is the world’s leading fruit crop, grown in almost 90 countries. In 2014, the world grape production was estimated at 737 Mqx. The number of grapevine varieties are estimated to be 5,000 worldwide, presenting a large genetic variability. In Portugal, 343 grapevine varieties are registered as being suitable to be used in wine production, of which 240 are thought to be autochthonous. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) are the smallest unit of inheritance and represent the most basic and abundant form of genetic sequence variation, being adequate for varietal discrimination. Several methods have been developed to detect SNPs. The aim of this work was to develop DNA-based assays suitable to detect SNP variation in V. vinifera allowing varietal discrimination. SNP detection was performed using a gene belonging to the anthocyanin pathway, flavanone 3-hydroxylase (F3H, EC: 1.14.11.9) which was sequenced in 21 V. vinifera varieties. The SNPs detected allowed to design two assays for High Resolution Melting and to design two probes, with different lengths, for the biosensor platform based on a long period grating fiber optic. The number of SNPs identified by sequencing within the F3H gene were 12, allowing the discrimination a total of 5 of the 21 grapevine varieties. The two assays developed for High Resolution Melting allowed the discrimination of two varieties: Tinta Roriz and Moscatel Galego. The remaining varieties were clustered according to the sequence information. The Biosensor was able to detect a difference of only one SNP, even with genomic DNA samples, where competitive mechanisms are present. The probe length used influenced the detection of the synthetic targets, having an inconsistent behaviour when the probe was 35 base long. However, when genomic DNA was used in the platform, this effect disappeared, being able to produce a statistical significant different shift, typical of the hybridization process. This sensor is highly sensitivity and specificity, label free, unresponsive to electromagnetic interferences, allowing real-time measurements and can be recovered. Two different platforms were successfully developed for grapevine varietal identification based on the F3H sequence.
Description: Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica
URI: http://hdl.handle.net/10348/7835
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:TD - Dissertações de Mestrado

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