Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/7883
Title: Resistência a antibióticos em Escherichia coli e Enterococcus spp. isolados da raça asinina de Miranda do Douro (Equus asinus)
Authors: Carvalho, Isabel Loreto Barroso de
Advisor: Poeta, Patrícia
Igrejas, Gilberto
Keywords: Enterococcus
Burro (Equus asinus)
Escherichia coli
Resistência a antibióticos
Virulência
Issue Date: 19-Jul-2017
Abstract: A raça asinina de Miranda do Douro (Equus asinus) é uma espécie em vias de extinção, endémica da região Nordeste de Portugal. Vários estudos têm sido feitos com o objetivo de promover a conservação desta espécie animal. A resistência aos antibióticos constitui uma problemática de saúde pública como consequência do uso incorrecto ou excessivo, tanto na prescrição clínica e medicina veterinária mas também na produção animal. As bactérias comensais habitantes do trato gastrointestinal, como Escherichia coli e Enterococcus spp., constituem um reservatório de genes de resistência que podem ser transferidos a outras bactérias comensais ou patogénicas. Com este trabalho, pretende-se compreender quais os mecanismos genéticos inerentes a essa resistência e identificar os fatores de virulência em E. coli e Enterococcus spp. isolados de asininos. Um total de 66 amostras fecais foram recolhidas em Março de 2014 e posteriormente semeadas em meios de Levine e Slanetz-Bartley (SB), suplementados e não suplementados com cefotaxima e vancomicina, respectivamente. Foram realizados os antibiogramas através do método da difusão em agar interpretado segundo as normas do Instituto de Padrões Clínicos e de Laboratório, CLSI (2015). A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) e electroforese em gel de agarose foram aplicadas na análise genotípica. Após análise da susceptibilidade dos antibióticos, foram isoladas 41 estirpes de E. coli e 41 estirpes de Enterococcus spp.. Nos isolados de E. coli, as resistências à estreptomicina (78%), tetraciclina e aminoglicosídeos (39%) foram as mais comuns, apesar de não terem sido observadas resistências ao cloranfenicol e cefoxitina. Constatou-se que 66,7% dos isolados resistentes ao sulfametoxazol/trimetropim continham o gene sul1 e/ou sul2 e ainda que os genes tet(A) e tet(B) foram amplificados em 50% dos isolados resistentes à tetraciclina. No entanto, não foram detectadas E. coli resistentes a β-lactamases de largo espectro (BLLE) em contraste com outros estudos realizados no mesmo âmbito (Al Atya et al., 2016; Clemente et al., 2015). Além disso, 9 isolados foram classificados como serótipos enteropatogénicos (grupo D), frequentemente associados a fatores de virulência [fim(A), cnf1 e aer]. As espécies de Enterococcus spp. foram identificadas por MALDI-TOF, no Laboratório de Microbiologia do Hospital Universitário Ramón y Cajal, em Madrid. E. faecium foi a espécie mais comum (61%), seguida por E. hirae (24%). Cerca de 68,3% dos isolados eram resistentes à tetraciclina, 51,2% à quinopristina-dalfopristina (QD) e 48,8% eram resistentes à ciprofloxacina. Além disso, constatou-se a presença de enterococci resistentes à vancomicina (VRE) em 8 dos 41 isolados (19,5%), superando a percentagem obtida com animais selvagens por Guerrero-Ramos et al. (2016). A presença dos genes erm(A) ou erm(B), tet(M) e/ou tet(L), vat(D) e/ou vat(E) e aph(3’)-IIIa foi confirmada. Destaca-se o facto de todos os isolados resistentes à canamicina conterem o gene aph(3’)-IIIa e que 19 dos 20 isolados resistentes à QD (95%) amplificaram os genes de resistência vat(D) ou vat(E). O gene de virulência detectado em maior percentagem foi gel(E), seguido pelos genes ace, cpd e hyl. De referir que foram ainda observados 9 isolados portadores de vários fatores de virulência testados, como ace, gel(E) ou cpd. Este foi o primeiro estudo específico realizado no âmbito da resistência aos antibióticos em asininos de Miranda e esta população pode constituir um potencial reservatório de genes de resistência e/ou virulência. Por este motivo, é recomendado um uso mais prudente destes fármacos na profilaxia e terapêutica não só nestes animais mas também nas outras espécies. Apesar da presença de bactérias resistentes, estas apresentam um baixo risco para o bem-estar de outros animais, incluindo o Homem, no contexto rural em que se encontram inseridos.
The Miranda donkey breed (Equus asinus) is an endemic species in danger of extinction in the North East of Portugal. Several studies have been done with the aim of promoting the conservation of this animal species. Commensal bacterias of the gastrointestinal tract, such as Escherichia coli and Enterococcus spp., are a reservoir of resistance genes that can be transferred to other commensal or pathogenic bacterias. Antibiotic resistance is a public health concern as a result of use, overuse and misuse in clinic prescription, veterinary medicine and also in animal production. In this study, we want to understand the genetic mechanisms associated with that resistance and identify the virulence factors in E. coli and Enterococcus spp. isolated from asinines. A total of 66 fecal samples were collected in March 2014 and they were sown on Levine and Slanetz Bartley agar, supplemented and none supplemented with cefotaxime and vancomycin, respectively. The antibiograms were performed using diffusion method on agar interpreted according to the norms of the Clinical Laboratory Standards Institute CLSI (2015). The Polymerase Chain Reaction (PCR) and agarose gel electrophoresis were applied in genothipic analyzing. After analyzing the susceptibility of antibiotics, we isolated 41 E. coli and 41 Enterococcus spp.. Among E. coli isolates, streptomycin (78%), tetracycline and aminoglycoside (39%) were the most common resistances, despite the resistance to chloramphenicol and cefoxitin that not be detected. It was found that 66.7% of sulfamethoxazole/trimethoprim resistant isolates had the genes sul1 and /or sul2 and that tet (A) and/or tet(B) genes were amplified in 50% of tetracycline resistant isolates. However, E. coli extended-spectrum β-lactamases were not detected, in contrast to other studies in the same field (Al Atya et al., 2016; Clemente et al., 2015; Gonçalves et al., 2014). Besides that, 9 isolates were classified as enteropathogens serotypes (group D) and they are often associated with virulence factors [fim(A), cnf1 e aer]. Enterococcus spp. species were identified by MALDI-TOF in the Microbiology Laboratory of the University Hospital Ramón y Cajal, in Madrid. E. faecium had been identified as the most common type (61%), followed by E. hirae (24%). Approximately 68.3% of the isolates were resistant to tetracycline, 51.2% to quinupristin-dalfopristin (Q-D) and 48.8% were resistant to ciprofloxacin. Moreover, Vancomicin Resistant Enterococci (VRE) were observed in 8 out of 41 isolates (19.5%), surpassing the percentages obtained by Guerrero-Ramos et al. (2016) with wild animals. The presence of erm(A) or erm(B), tet(M) and/or tet(L), vat(D) and/or vat(E) and aph(3')-IIIa genes was confirmed. All of the kanamycin resistant isolates had the gene aph(3')-IIIa and 19 of the 20 Q-D resistant isolates (95%) amplified vat(D) and/or vat(E) genes. The virulence gene most detected was gel(E), followed by ace, cpd and hyl genes. It should be important that 9 isolates were detected with different virulence factors as ace, gel(E) or cpd. This is the first communication about antibiotic resistance in Miranda donkey and this population could be reservoirs of resistance and/or virulence genes. Because of this reason, it is recommended a more prudent use of antimicrobials in prophylaxis and therapy not only in those animals but also in other species. Despite the presence of resistant bacteria, they present a low risk to the welfare of other animals, including Humans, in the rural context in which they are inserted.
Description: Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
URI: http://hdl.handle.net/10348/7883
Document Type: Master Thesis
Appears in Collections:TD - Dissertações de Mestrado

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