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dc.contributor.advisorSilva, Amélia Maria Lopes Dias da-
dc.contributor.advisorReis, Lucinda Vaz dos-
dc.contributor.authorSiopa, João Rafael Rodrigues-
dc.date.accessioned2017-09-18T11:52:05Z-
dc.date.available2017-09-18T11:52:05Z-
dc.date.issued2017-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10348/8060-
dc.descriptionDissertação de Mestrado em Bioquímicapt
dc.description.abstractA terapia fotodinâmica (PDT - do Inglês Photodynamic Therapy) é uma técnica terapêutica baseada numa reação fotoquímica que conjuga uma molécula fotossensibilizadora, oxigénio molecular e luz, sendo usada em tratamentos de várias doenças, não só como em alguns tipos de cancros, mas também de lesões não-malignas. Foi introduzida no século XX e, consiste na administração de um agente fotossensibilizador (FS) que, quando irradiado a comprimentos de onda e intensidades adequadas, é ativado e produz espécies citotóxicas capazes de destruir o tecido afetado. Dentro dos FSs usuais, os corantes, em particular as cianinas esquarílicas (usadas neste estudo), são um grupo de compostos que têm vindo a despertar o interesse nesta área terapêutica pela eficácia fotossensibilizante que apresentam. Contudo, o conhecimento dos mecanismos subjacentes à ação destas moléculas fotossensibilizadoras em modelos biológicos ainda é escasso, pelo que constituem os objetivos principais desta dissertação. Neste trabalho foram estudados alguns mecanismos de atuação de quatro cianinas esquarílicas assimétricas, sintetizadas previamente, quando excitadas a um comprimento de onda adequado usando modelos in vitro (células Caco-2, uma linha tumoral e uma linha de tecido normal, células HaCaT). Estudou-se o seu efeito na viabilidade celular, dependente de tempo de exposição, concentração e presença (ou não) de irradiação adequada, na produção de espécies reativas de oxigénio (ROS), na indução de fragmentação de DNA e na expressão de proteínas da apoptose. Verificou-se que, de um modo geral, as cianinas estudadas promoveram a redução da viabilidade celular, quando ativadas pela luz, em ambas as linhas celulares, sendo essa redução de viabilidade dependente do tempo de exposição. A exposição das células aos FSs irradiados, promoveu o aumento da produção de ROS, (observado através da sonda 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCFDA)), comparativamente aos ensaios não irradiados, sendo esse aumento maior quando se aplicaram as cianinas esquarílicas B e C (CEsq-B e C).Observou-se também um aumento na fragmentação de DNA (através da sonda Hoescht 33342) após a exposição das células aos FSs irradiados, verificando-se que a CEsq-C é a que provoca maior fragmentação de DNA em células Caco-2 (80,37 ± 9,56 % de células com DNA fragmentado) e, em células HaCaT, a CEsq-B foi a que mais se destacou (18,77 ± 4,40 % de células com DNA fragmentado). A expressão de AIF (fator indutor de apoptose), proteína envolvida na indução da fragmentação de DNA e que também promove a apoptose, foi detetada por imunocitoquímica, apresentando maior expressão no citoplasma em células que foram expostas durante 1 hora à CEsq-A, que foi também esta a cianina que apresentou menos fragmentação de DNA. Nas células expostas às outras cianinas (CEsq-B, C e D), observou-se uma expressão de AIF a nível citoplasmático e nuclear, o que corrobora o fato de estas cianinas apresentarem níveis mais elevados de fragmentação de DNA. Tendo em conta o coeficiente de partição (maiores que 1,0 para todas as cianinas), e ensaios de retenção dos FSs na membrana celular, foi possível concluir que os corantes são retidos nas células ficando em contacto direto com as membranas celulares. Contudo, o mecanismo que permite esta retenção não foi ainda esclarecido. Os mecanismos de morte não foram completamente desvendados, dado que não foi possível concluir quanto à via de apoptose envolvida. Os resultados apontam para o possível envolvimento de outros mecanismos de morte celular, como a necrose e a autofagia, sendo necessários mais estudos para os esclarecer.pt
dc.description.abstractPhotodynamic therapy (PDT) is therapeutic technique based on a photochemical reaction that combines a photosensitizer molecule, molecular oxygen and light, being used in treatments of various diseases, not only as in such as some types of cancer, but also for non-malignant lesions. Introduced in the 20th century, it consists in the administration of a photosensitizer agent (FS) which, when irradiated at appropriate wavelengths and intensities, is activated and produces cytotoxic species capable of destroying the affected tissue. Within the usual FSs, the dyes, in particular the squarylium cyanines (used in this study), are a group of compounds that have aroused interest in this therapeutic area due to the photosensitizing efficacy that they present. However, knowledge about the mechanisms underlying the action of these photosensitizer molecules in biological models is still scarce and therefore constitutes the main objectives of this dissertation. In this work, we investigated some mechanisms of action of four unsymmetrical squarylium cyanines, previously synthesized, when excited at appropriate wavelengths using in vitro models (Caco-2 cells, a tumoral cell line and a non-tumoral cell line, HaCaT cells). Its effects on the production of reactive oxygen species (ROS), on DNA fragmentation induction and the on the expression of apoptotic proteins were studied. It was observed that, in general, these cyanines promoted a time and concentration-dependent reduction on cell viability, when activated by light, in both cell lines. Cells exposure to the irradiated FSs promoted and increase in ROS production (observed through the DCFDA probe), when compared with the non-irradiated cells, and this increase was greater to CEsq-B and C. An increase in DNA fragmentation (through the Hoescht 33342 probe) was also observed after exposure of the cells to irradiated FSs, with CEsq-C causing the greatest fragmentation in Caco-2 cells (80.37 ± 9.56% of cells with fragmented DNA) and CEsq-B the most prominent in HaCaT cells (18.77 ± 4.40% of cells with fragmented DNA). Expression of AIF (apoptosis inducing factor), a protein related to DNA fragmentation and that promotes apoptosis, was also analysed, it was more expressed in the cytoplasm of the cells that were exposed for 1 hour to irradiated CEsq-A, but this cyanine sowed the less DNA fragmentation. In the cells exposed to the other cyanines, the expression of AIF was cytosolic and nuclear, and it is correlated with higher values of DNA fragmentation. Regarding the partition coefficient (greater than 1.0 μM for all the cyanines), and the capacity of FSs retention in the cell’s membranes, it was concluded that dyes are retained in the cells being in direct contact with cell membranes. However, the mechanisms responsible for that retention were not clarified yet. The mechanisms of cell’s death induced by exposure to cyanines have not yet been fully elucidated, as it was not possible to conclude on the apoptosis pathway involved. The results point to the possible involvement of other mechanisms of cell’s death, such as necrosis and autophagy, requiring further studies to clarify them.pt
dc.language.isoporpt
dc.rightsclosedAccesspt
dc.subjectBioquímicapt
dc.subjectMorte celularpt
dc.subjectFragmentação do DNApt
dc.subjectApoptosept
dc.subjectCélulas Caco-2pt
dc.subjectCélulas HaCaTpt
dc.subjectCianinas esquarílicaspt
dc.titleMecanismos celulares subjacentes à potencial ação fotodinâmica induzida por corantes cianínicos esquarílicospt
dc.typemasterThesispt
dc.subject.udc577(043)pt
dc.subject.udc576.38(043)pt
dc.identifier.tid202032353-
Appears in Collections:TD - Dissertações de Mestrado

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