Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10348/8085
Title: Contribution to the study of the rat model of renal mass reduction: the effect of chaetomellic acid A
Authors: Nogueira, António José Madeira
Advisor: Pires, Maria João Miranda
Oliveira, Paula Alexandra Martins de
Keywords: Ratos Wistar
Animais de laboratório
Insuficiência renal crónica
Nefrectomia
Ultrassonografia
Rim
Fibrose
Stresse oxidativo
Ácido catomélico
Issue Date: 9-Oct-2017
Abstract: A doença renal crónica é um grave problema de saúde pública com elevada prevalência e mortalidade. Estima-se que esta doença afete aproximadamente 8-16% da população. Durante a progressão da doença renal crónica o número de nefrónios vai diminuindo e são gradualmente substituídos pela acumulação de matriz extracelular, que consequentemente leva a glomeruloesclerose e a fibrose tubulointersticial. Neste sentido, tem sido referido que a proteína H-Ras está associada ao desenvolvimento de fibrose renal, como também ao aumento do stresse oxidativo. O modelo de redução de 5/6 da massa renal em ratos é frequentemente usado para estudar os mecanismos na progressão da doença renal crónica, nomeadamente a fibrose renal. Neste modelo, a redução da massa renal é obtida por nefrectomia direita, seguida pela remoção de dois terços do rim esquerdo, com uma redução de massa renal superior a 85%. Sabe-se que neste modelo, após a redução da massa renal, os animais desenvolvem hipertrofia glomerular, atrofia tubular, inflamação, stresse oxidativo e fibrose renal. Foram objetivos desta tese de doutoramento avaliar os efeitos do tratamento crónico com o ácido catomélico A (ACA), um inibidor específico da ativação da proteína H-Ras, nas alterações induzidas pela redução de 5/6 da massa renal em ratos machos Wistar (Rattus norvegicus), particularmente na função renal, stresse oxidativo e fibrose renal; caracterizar as alterações renais associadas com redução da massa renal por ultrassonografia e avaliar a correlação dos parâmetros ultrassonográficos com os resultados bioquímicos e histológicos. Neste protocolo experimental foram utilizados 60 ratos machos Wistar, dos quais 7 morreram após a cirurgia. Uma semana após a cirurgia, os restantes 53 foram divididos em quatro grupos experimentais: ratos em que foi simulada a cirurgia (SO) (n=13), SO+ACA (n=13), ratos que sofreram redução de 5/6 da massa renal (RMR) (n=14) e RMR+ACA (n=13). Aos animais dos grupos SO+ACA e RMR+ACA, uma semana após a cirurgia, foi administrado intraperitonealmente ACA (0.23 μg/kg) três vezes por semana durante seis meses consecutivos. Uma vez por mês foram recolhidas amostras de urina de 24 horas e de sangue para posterior avaliação da função renal. No 3º e 6º mês, após a cirurgia, foi avaliado em cada animal o tamanho e a ecogenicidade do rim esquerdo por ultrassonografia utilizando o modo bidimensional US (modo B). No 6º mês, após a cirurgia, foi também avaliada a fibrose renal através deste método ultrassonográfico. Ao longo do estudo morreram 2 animais do grupo RMR e 5 do grupo RMR+ACA. No final do estudo os restantes animais foram anestesiados com uma overdose de isoflurano seguida da eutanásia por exsanguinação e submetidos a necrópsia. Posteriormente, os rins esquerdos foram removidos e processados para avaliação da fibrose renal e análise de stresse oxidativo. De acordo com os nossos resultados, o grupo RMR apresentou ecogenicidade cortical e medular significativamente (p<0,05) maior quando comparado com o grupo SO; e ecogenicidade medular significativamente (p<0,05) maior quando comparado com o grupo RMR+ACA. No 3º mês após a cirurgia, observou-se uma correlação estatisticamente significativa (p<0,05) entre a creatinina plasmática e o comprimento renal. Os animais do grupo RMR+ACA apresentaram um menor grau de lesões renais (glomeruloesclerose, fibrose intersticial, inflamação intersticial, arteriosclerose e dilatação tubular). É importante salientar que a glomeruloesclerose e a arteriosclerose foram significativamente (p<0,001) menores no grupo de RMR+ACA quando comparado com o grupo RMR. Os nossos resultados, obtidos utilizando a ultrasonografia, estavam de acordo com os obtidos através das análises histopatológicas. A redução de massa renal foi acompanhada por uma redução significativa (p<0,05) da atividade da catalase e da glutationa redutase, aumento dos níveis de peroxidação lipídica e redução do rácio glutationa reduzida/glutationa oxidada. A administração de ACA aumentou significativamente (p<0,05) a atividade da catalase e da glutationa redutase, reduziu os níveis de peroxidação lipídica e aumentou o rácio glutationa reduzida/glutationa oxidada, contudo não foram obtidas diferenças significativas para a peroxidação lipídica e rácio glutationa reduzida/glutationa oxidada. Embora não tenham sido encontradas diferenças significativas entre os grupos de RMR em qualquer dos parâmetros da função renal avaliados (densidade urinária, fluxo urinário, proteinúria, creatinina na urina; azoto ureico, creatinina, fósforo e potássio plasmáticos; depuração da creatinina) a administração de ACA melhorou ligeiramente estes parâmetros. A administração de ACA durante um período de seis meses atenuou o stresse oxidativo e impediu a progressão da fibrose renal no modelo de redução de 5/6 da massa renal. Estes resultados demonstram a necessidade de realizar outros estudos in vivo com o ACA para avaliar a sua ação terapêutica noutras doses e determinar a toxicidade do ACA, no sentido de explorar a sua segurança como potencial terapêutica futura no tratamento da doença renal crónica.
Chronic kidney disease is a serious public health problem, with a high prevalence and mortality. It is estimated that has a prevalence of approximately 8-16%. During chronic kidney disease progression the number of nephrons decreases, being replaced by the accumulation of extracellular matrix, which consequently leads to glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis. It has been reported that the H-Ras protein is associated with development of renal fibrosis, as well as with oxidative stress increase. The 5/6 renal mass reduction model in rats is frequently used to study the mechanisms in the progression of chronic kidney disease, namely renal fibrosis. In this model, the renal mass reduction is achieved by right nephrectomy, followed by the removal of two-thirds of the left kidney, with a renal mass reduction superior to 85%. It is well known that in this model, after renal mass reduction, the animals develop glomerular hypertrophy, tubular atrophy, inflammation, oxidative stress and renal fibrosis. In this PhD thesis we aimed to evaluate the effects of chronic treatment with chaetomellic acid A (CAA), a specific inhibitor of the H-Ras protein activation, in the alterations induced by the 5/6 renal mass reduction in male Wistar rats (Rattus norvegicus), particularly in the renal function, oxidative stress and renal fibrosis. We also characterized the kidney alterations associated with renal mass reduction by two-dimensional ultrasound and assess the correlation of the ultrasonographic parameters with the histological and biochemical findings. During experimental protocol were used 60 male Wistar rats, of which 7 died after surgery. One week after surgery, the remaining 53 were divided into four experimental groups: sham-operated (SO) rats SO (n=13), SO+CAA (n=13); and rats which underwent 5/6 renal mass reduction (RMR) (n=14), RMR+CAA (n=13). Animals from SO+CAA and RMR+CAA, one week after surgery, groups were intraperitoneally administered with CAA (0.23 μg/kg) three times a week for six consecutive months. Once a month were obtained twenty-four-hour urine samples and blood samples for posterior renal function evaluation. At the 3rd and 6th months after surgery the size and echogenicity of the left kidney of each animal were evaluated by ultrasonography using two-dimensional US (B mode). At the 6th month after surgery was also evaluated the renal fibrosis through the same ultrasonography methodology. Throughout the study protocol 2 animals from RMR group and 5 animals from RMR+CAA group died. At the end of the study, the remaining animals were anesthetized with an overdose of isoflurane followed by exsanguination euthanasia and submitted to necropsy. Subsequently, the left kidneys were removed and processed for renal fibrosis evaluation and oxidative stress analysis. According to our results RMR group presented cortical and medullary echogenicity significantly (p<0.05) higher when compared with the SO group; and medullary echogenicity significantly (p<0.05) higher when compared with the RMR+CAA group. It was observed a statistically significant correlation (p<0.05) between the plasma creatinine and the renal length 3 months after surgery. The animals from the RMR+CAA group exhibited a lower grade of renal lesions (glomerulosclerosis, interstitial fibrosis, interstitial inflammation, arteriosclerosis and tubular dilation). It was noteworthy that the glomerulosclerosis and arteriolosclerosis were significantly (p<0.001) lower in RMR+CAA group when compared with RMR group. Our results, obtained using ultrasonography, were in agreement with those obtained by the histopathological studies. The renal mass reduction was accompanied by a significant (p<0.05) reduction in catalase and glutathione reductase activity, increased levels of lipid peroxidation and a decrease in reduced glutathione/oxidized glutathione ratio. CAA administration significantly (p<0.05) increased catalase and glutathione reductase activity, reduced levels of lipid peroxidation and increased reduced glutathione/oxidized glutathione ratio, but no significant differences were obtained for lipid peroxidation and reduced glutathione/oxidized glutathione ratio. Although no significant differences were found between the RMR groups in any of the biochemical parameters of renal function (urine specific gravity, urinary flow, proteinuria, urine creatinine; blood urea nitrogen, plasmatic creatinine, phosphorus and potassium; creatinine clearance), CAA administration slightly improved these parameters. The CAA administration for a six months period attenuated the oxidative stress and prevented the progress of renal fibrosis in the 5/6 renal mass reduction model. These results demonstrate the necessity of further in vivo studies with CAA in order to assess its therapeutic action with other doses and determine its toxicity, exploring its safety as a future potential therapeutic in the treatment of chronic kidney disease.
Description: Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias - Ciências Biomédicas
URI: http://hdl.handle.net/10348/8085
Document Type: Doctoral Thesis
Appears in Collections:TD - Teses de Doutoramento

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