Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/8633
Título: Antimicrobial resistance, biofilm formation and cell invasion by bacteria isolated from wild animals: potential impact in animal and human health
Autor: Dias, Carla Sofia Pereira
Orientador: Saavedra, Maria José Félix
Simões, Manuel José Vieira
Data: 13-Mar-2018
Resumo: Antibiotics were originally developed for the treatment of bacterial infectious diseases. However, antibiotic resistance thwarts the treatment of infectious diseases globally, representing one of the most serious public health problems. The emergence of increasing numbers of antibiotic-resistant pathogens, some of which resistant to multiple classes of antibiotics, has implications not only for veterinary patients but also humans. Additionally, during the last years, wildlife has also been an important source of bacterial infectious diseases transmissible to humans. Zoonoses with a wild animal reservoir constitute a major public health concern worldwide, and the need for more attention in this area is consistently increasing. Bacteria can resist the action of antibiotics through several mechanisms, including antibiotic target modification, enzymatic inactivation or modification and prevention of access to antibiotic target. Another important factor that significantly contributes to increase antibiotic of resistance among pathogenic microorganisms is their ability to form biofilms. Biofilms are dynamic and complex systems, with characteristics of both primordial multicellular organisms and multifaceted ecosystems. Taking into consideration the public health concern on emerging antibiotic resistance, it becomes crucial to study the importance of wild animals as reservoirs of antibiotic resistant bacteria and their ability to form biofilms and interact with human cells. The main goal of this study was to provide information about the presence and behavior of antibiotic resistant bacteria from selected wild animals of the North of Portugal. Therefore, bacteria isolated from wild animals were selected for identified, and characterized for their antibiotic susceptibility profile, in both planktonic and sessile states. The ability of some strains to survive under human gastrointestinal conditions was evaluated. Moreover, their ability to attached/internalized the human colon adenocarcinoma cells line (Caco-2), and produced virulence factors, namely N-acyl homoserine lactones (AHLs), siderophores, proteases and gelatinases was also assessed. The identification of 20 strains was accomplished by phenotypic analysis, and 16s rDNA and gyrB sequencing. Sixteen strains were identified as belonging to the genus Aeromonas. On the basis of gyrB sequence alignments it was observed that the strains were clustered in 4 phylogenetic groups with 9 gyrB different sequences: Aeromonas salmonicida, A. eucrenophila, A. bestiarum and A. veronii. The remaining strains belong to the genera Acinetobacter, Pseudomonas, Klebsiella and Shewanella. The study of the bacterial antimicrobial susceptibility profile of 29 antibiotics was assessed by disc diffusion assay. The antibiogram of the strains demonstrated that all 20 strains are multiresistant to antibiotics, i.e., have resistance to more than two group of antibiotics. The presence of different antibiotic resistance genes was investigated by PCR. Based on the bla-encoding genes, OXA-aer and FOX were the most detected β-lactamases. Biofilm formation of 18 strains, of the genus Acinetobacter, Aeromonas, Klebsiella, Pseudomonas and Shewanella, was assessed in microtiter plates and quantified using crystal violet (CV) staining. The overall results demonstrate that the strains showed different ability to form biofilms, even if some strains are of the same species, suggesting that adhesion and biofilm formation is a strain dependent process. The activity of ciprofloxacin (CIP) on the control of Aeromonas spp. biofilms and the effect of imipenem (IPM) on Acinetobacter spp. AS0027A3a, K. pneumoniae AS027A2, P. fluorescens AS008A1 and S. putrefaciens AS006C2 biofilms, revealed that antibiotics at their minimum inhibitory concentrations (MIC) and at 10× MIC were ineffective in total biofilm removal. Evaluation of the ability of A. salmonicida AS006C3c1, A. veronii AS070GSP1, Acinetobacter spp. AS027A3a, K. pneumoniae AS027A2, P. fluorescens AS008A1 and S. putrefaciens AS006C2 to survive under simulated human gastrointestinal tract conditions, revealed that two strains (A. salmonicida AS006C3c1 and K. pneumoniae AS027A2), are capable to survive for more than 24 hours under simulated human gastrointestinal tract conditions. Furthermore, all six strains were selected to determinate their ability of adhesion and invasion of human colon adenocarcinoma cells line (Caco-2 cells line). All the strains were able to attach to Caco-2 cells, among them A. salmonicida AS006C3c1 was the strain that presented the largest number of attached cells. When studying only Caco-2 cells invasion it was found that the strain with the highest invading capacity was P. fluorescens AS008A1. The results collected in this work allowed to conclude that the presence of multiple antibiotic resistance and genetic determinants of resistance in these strains isolated from wild animal reveals a potential significant public health impact. Their ability to form biofilms increases the potential to resist antimicrobial treatments and therefore persist in the colonizing ecosystem
Os antibióticos foram originalmente desenvolvidos para o tratamento de doenças infeciosas. No entanto, a resistência aos antibióticos tem vindo a dificultar globalmente o tratamento das doenças infeciosas. Hoje em dia, tem-se verificado um aumento do número de agentes patogênicos resistentes, alguns dos quais resistentes a múltiplas classes de antibióticos, com implicações tão para os animais como para o homem. Nos últimos anos, tem sido reconhecida a importância dos animais selvagens na transmissão de doenças infeciosas. As zoonoses representam um grande problema de saúde pública, o que levou a um aumento da vigilância na prevenção e controlo de doenças envolvendo o homem e animais. As bactérias podem desenvolver vários mecanismos de resistência aos antibióticos, tais como: alteração do local alvo do antibiótico, modificação e degradação enzimática, prevenção do acesso do antibiótico ao alvo. Outro fator importante que contribui significativamente para o aumento da resistência é a capacidade dos microrganismos para desenvolverem biofilmes. Os biofilmes são sistemas dinâmicos e complexos, com caraterísticas tanto de organismos multicelulares primordiais como de ecossistemas multifacetados. Considerando o problema de saúde pública causado com o aumento de bactérias multirresistentes no ambiente, é crucial conhecer a importância dos animais selvagens como reservatórios de bactérias multirresistentes e sua capacidade de formar biofilmes e invadirem às células humanas. O principal objetivo deste estudo foi fornecer informação sobre a presença e o comportamento de bactérias resistentes em animais selvagens selecionados no Norte de Portugal. Algumas bactérias isoladas foram selecionadas para identificação e avaliou-se o seu perfil de susceptibilidade no estado planctónico e séssil. Foi avaliada a capacidade de algumas estirpes sobreviverem sob condições do trato gastrointestinal humano. Além disso foi determinada a capacidade de adesão e invasão à linha celular adenocarcinoma do cólon humano (Caco-2), e a capacidade de produção de factores de virulência: N-acil homoserina lactonas (AHLs), sideróforos, proteases e gelatinases. A identificação de 20 estirpes foi realizada por análise fenotípica e sequenciação dos genes 16s rDNA e gyrB. Foram identificadas 16 estirpes como pertencentes ao género Aeromonas. Com base nos alinhamentos das sequências de gyrB observou-se que as estirpes se agrupavam em 4 grupos filogenéticos com 9 sequências diferentes de gyrB: Aeromonas salmonicida, A. eucrenophila, A. bestiarum e A. veronii. As restantes estirpes pertencem aos géneros Acinetobacter, Pseudomonas, Klebsiella e Shewanella. O estudo do perfil de susceptibilidade a 29 antibióticos foi avaliado por meio de ensaio de difusão do disco. O antibiograma das estirpes demonstrou que todas eram multirresistentes, isto é, apresentam resistência a mais do que dois grupos de antibióticos. A presença de β-lactamases foi avaliada por PCR, tendo sido as enzimas OXA-aer e FOX as mais detetadas. A formação de biofilmes de 18 estirpes, dos géneros Acinetobacter, Aeromonas, Klebsiella, Pseudomonas e Shewanella, foi avaliada em placas de microtitulação e quantificada por coloração com cristal de violeta (CV). Os resultados globais demonstram que as estirpes apresentaram diferentes habilidades para formar biofilme, mesmo as estirpes pertencentes à mesma espécie. Estes dados sugerem que a adesão e formação de biofilme é um processo dependente da estirpe. Foi ainda avaliada a atividade da ciprofloxacina (CIP) no controlo da formação de biofilmes. Além disso, o efeito do imipenemo (IPM) também foi testado em quatro estirpes (Acinetobacter spp. AS0027A3a, P. fluorescens AS008A1, K. pneumoniae AS027A2, S. putrefaciens AS006C2). Observou-se que a concentração mínima inibitória (MIC) e 10× MIC foram ineficazes na remoção total do biofilme. A avaliação da capacidade das estirpes A. salmonicida AS006C3c1, A. veronii AS070GSP1, Acinetobacter spp. AS0027A3a, K. pneumoniae AS027A2, P. fluorescens AS008A1, S. putrefaciens AS006C2 para sobreviver sob condições simuladas do trato gastrointestinal humano, revelou que duas estirpes (A. salmonicida AS006C3c1 e K. pneumoniae AS027A2) são capazes de sobreviver por mais de 24 horas sob condições simuladas do trato gastrointestinal humano. Além disso, as seis estirpes foram selecionadas para determinar sua capacidade de adesão e invasão da linha celular do adenocarcinoma do cólon humano (Caco-2). Todas as estirpes foram capazes de aderir às células Caco-2, entre elas, A. salmonicida AS006C3c1 foi a que apresentou o maior número de células aderidas. Ao estudar apenas a invasão das células Caco-2, observou-se que P. fluorescens AS008A1 era a que apresentava maior capacidade de invasão. Os resultados deste trabalho permitiram concluir, que a presença de determinantes genéticos de resistência em bactérias isoladas de animais selvagens revelam uma grande importância para a saúde pública. A capacidade de formação de biofilmes aumenta o potencial dos microrganismos para resistir aos tratamentos antimicrobianos e, portanto, a sua persistência no ecossistema colonizado.
URI: http://hdl.handle.net/10348/8633
Tipo de Documento: Tese de Doutoramento
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