Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/8800
Título: Cancer cells: a crosstalk between general metabolism and sensitivity to apoptotic signals
Autor: Fernandes, Andreia Silva
Orientador: Videira, Romeu António
Oliveira, Maria Manuel Silva
Palavras-chave: Cancer
mitochondria
metabolism
apoptosis
ROS
Redox potential
Data: 18-Dez-2017
Resumo: The transformation of a normal cell into a cancer cell is a pathological process involving several stages, which modifies cellular metabolism and supports: rapid generation of ATP, high rate of macromolecules biosynthesis and maintenance of the appropriate cellular redox state. Mitochondria play a central role in the eukaryotic cell because of their relevance in biosynthetic and bioenergetic metabolisms. Additionally, mitochondria are also responsible for the production and/or control of various types of signals (including molecules), involved in cellular signalling processes that modulate various aspects of the functional organization of cells and their interaction with neighbouring cells. For example, this organelle is particularly associated with the processes of cell death by apoptosis. In this context, the development and progression of oncologic disease is inevitably associated with changes in metabolic pathways/signalling that involve mitochondria. Two models of human cancer cells, notably A549 cells (representative of non-small cell lung cancer) and AGS cells (representative of stomach cancer promoted by intestinal type cells), are used in the present work to investigate the relationship between metabolic parameters and sensitivity of cancer cells to apoptotic stimuli. This aspect is fundamental to understanding the mechanisms used by cancer cells to develop resistance to conventional chemotherapy and also to develop new and more effective therapeutic strategies. The results obtained show that these two cell lines show distinct profiles of growth curves. The cell proliferation rate (inversely proportional to the doubling time) of A549 cells is slightly higher than AGS cells. However, when compared to A549 cells, AGS cells exhibit higher intracellular glycogen content, higher MTT reduction ability and much higher mitochondrial functionality, as revealed by the parameters that characterize mitochondrial respiration (basal respiration, respiration associated with synthesis of ATP and maximum breathing capacity). Additionally, the lipid composition of the membranes of these cells also depends on the cell type. When normalized by the amount of protein, A549 cells exhibit higher lipid content (phospholipids + cholesterol) but lower glycolipid content than AGS cells. Analysis of the fatty acid profiles revealed that A549 cells exhibit lower relative abundance of saturated fatty acids, higher abundance of monounsaturated fatty acids and a higher ratio of Omega6/Omega-3 polyunsaturated fatty acids to those of AGS cells. The characterization of the oxidation-reduction cell state was evaluated by the GSH/GSSG ratio. The activity of the enzymatic antioxidant defences and the rate of production of reactive oxygen species follow a pattern consistent with the metabolic differences presented by the two cell lines. Thus, AGS cells exhibit Catalase and Superoxide dismutase (SOD) activities superior to A549 cells, despite their r viii intracellular compartments are, in average, a more oxidized state, as suggested by the lower ratio GSH/GSSG. Notwithstanding these differences, the ROS production rate is similar in both cell lines. Considering the effect of increasing concentrations of staurosporine on cell viability, AGS cells (IC50 = 20.5 nM) are shown to be significantly more sensitive than the A549 cells (IC50 = 108.0 nM) to this apoptotic agent. Staurosporine, at the concentration of IC50 for each cell line, promotes a significant decrease in the electrical potential across the mitochondrial inner membrane (ΔΨm) in both cell lines without affecting ROS generation. Additionally, the A549 cell line was shown to exhibit ΔΨm significantly higher than the AGS cell line, exhibiting more hyperpolarized mitochondria. The impact of the destruction of the extracellular matrix (through trypsin activity) in the oxidationreduction cell, ΔΨm and ROS production was also evaluated in both cell lines. The trypsinization process destroys the extracellular matrix and transforms adherent cells into mobile/floating cells, promoting in both cell lines a significant increase in ROS production. These effects are more evident in A549 cells. The increase in ROS production rate is accompanied by a decrease in the GSH/GSSG ratio and an increase of ΔΨm; and again, these effects are also more evident in A549 cells. Together, the results support the idea that the higher tumour aggressiveness of A549 cells, compared to AGS cells, detected by the higher rate of cell proliferation and the greater the ability to evade apoptosis (less sensitivity to staurosporine) are reflex of the glycolytic phenotype. This phenotype is characterized by hyperpolarized mitochondria, lower respiratory activity and supported by a lower intracellular environment. Moreover, A549 cells showed their membrane lipids with superior abundance of monounsaturated fatty acids and higher omega-6/omega-3 ratio. At last, when the cells are no longer bound to the extracellular matrix, mimic by trypsinization process, their mitochondria becomes more hyperpolarized, ROS production increases and their intracellular environment becomes more oxidized, increasing their tumour aggressiveness.
A transformação de uma célula normal numa célula cancerosa é um processo patológico que ocorre simultaneamente em várias etapas. Estas alterações ocorrem de forma a modificar o metabolismo celular assegurando a rápida produção de ATP, a alta taxa de biossíntese de macromoléculas e a manutenção do estado redox celular. A mitocôndria desempenha um papel central na célula eucariota, pela sua relevância nos metabolismos biossintético e bioenergético. Adicionalmente, as mitocôndrias são também responsáveis pela produção e/ou controlo de vários tipos de sinais (incluindo moléculas) envolvidos nos processos de sinalização celular que modulam vários aspetos da organização funcional das células, incluindo a sua interação com células vizinhas. Por exemplo, este organelo está particularmente associado aos processos de morte celular por apoptose. Neste contexto, o desenvolvimento e a progressão da doença oncológica está inevitavelmente associada com alterações nas vias metabólicas/sinalização que envolvem a mitocôndria. Dois modelos de células de cancro humano, nomeadamente células A549 (representativas de carcinoma do pulmão ligado às células “não pequenas”) e células AGS (representativas do cancro do estômago promovido por células do tipo intestinal), são usados no presente trabalho para investigar a relação entre parâmetros metabólicos e a sensibilidade das células cancerosas a estímulos apoptóticos. Este aspeto é fundamental para compreender os mecanismos usados pelas células cancerosas para desenvolver resistência à quimioterapia convencional e também para desenvolver novas estratégias terapêuticas mais eficazes. Os resultados obtidos mostram que estas duas linhas celulares apresentam curvas de crescimento distintas, sendo a taxa de proliferação celular (inversamente proporcional ao do tempo de duplicação) das células A549 ligeiramente superior à das células AGS. Todavia quando comparadas com as células A549, as células AGS apresentam maior conteúdo intracelular de glicogénio, exibem maior capacidade de redução do MTT e exibem uma funcionalidade mitocondrial muito superior, como é mostrado pelos parâmetros que caracterizam a respiração mitocondrial (respiração basal, respiração associada com a síntese de ATP e capacidade máxima de respiração). Adicionalmente, a composição lipídica das membranas destas células também é dependente do tipo de célula. Quando normalizado pela quantidade de proteína, as células A549 apresentam maior conteúdo lipídico (fosfolípidos + colesterol) mas menor teor de glicolípidos do que as células AGS. A análise dos perfis de ácidos gordos revelou que as células A549 apresentam menor abundancia relativa de ácidos gordos saturados, maior abundancia de ácidos gordos monoinsaturados e uma razão de ácidos gordos polinsaturados Omega-6/Omega-3 superior às das células do AGS. A caracterização do estado de oxidação-redução das células (avaliado pela razão GSH/GSSG), da atividade das defesas antioxidantes enzimáticos e da taxa de produção de espécies reativas de oxigénio mostrou que estes parâmetros seguem um padrão consistente com as diferenças metabólicas apresentadas pelas duas linhas celulares. Assim, as células AGS apresentam uma atividade dos dois tipos de sistemas enzimáticos, Catalase e Superóxido dismutase (SOD), superior à das células A549, apesar de, em média, os seus compartimentos intracelulares estarem num estado mais oxidado, como sugerido pela menor razão GSH/GSSG. Apesar destas diferenças, a taxa de produção ROS é semelhante em ambas as linhas celulares. Considerando o efeito de concentrações crescentes de staurosporina na viabilidade celular, mostrou-se que as células AGS (IC50 = 20,5 nM) são significativamente mais sensíveis do que as células A549 (IC50 = 108,0 nM) a este agente apoptótico. A staurosporina, à concentração do IC50 para cada linha celular, promove em ambas as linhas celulares uma diminuição significativa do potencial elétrico através da membrana interna mitocondrial (ΔΨm) sem afetar a geração de ROS. Adicionalmente, mostrou-se também que a linha celular A549 exibe um ΔΨm significativamente maior do que a linha celular AGS, apresentando estas células mitocôndrias mais hiperpolarizadas. O impacto da destruição da matriz extracelular (através da atividade da tripsina) no estado de oxidaçãoredução celular, no ΔΨm e na produção de ROS foi também avaliado em ambas as linhas celulares. O processo de tripsinização destrói a matriz extracelular e transforma células aderentes em células móveis/flutuantes, promovendo, em ambas as linhas celulares, um aumento significativo na produção de ROS; sendo os efeitos mais evidentes nas células A549. O aumento da taxa de produção de ROS é acompanhado pela redução da razão GSH/GSSG e por um aumento do ΔΨm, sendo estes efeitos também mais evidentes nas células A549. Em conjunto, os resultados obtidos suportam a ideia de que a maior agressividade tumoral das células A549, em comparação com células AGS, detetadas pela maior taxa de proliferação celular e pela maior capacidade de evasão à apoptose (menor sensibilidade à staurosporina) são reflexo do seu fenótipo glicolítico. Este fenómeno glicolítico é caracterizado por mitocôndrias hiperpolarizadas e com menor atividade respiratória, suportadas também por um ambiente intracelular menos reduzido e lípidos membranares com maior abundancia de ácidos gordos monoinsaturados e maior razão ómega-6/ómega3. Adicionalmente, quando as células deixam de estar ligadas à matriz extracelular, processo de tripsinização, a sua mitocôndria torna-se mais hiperpolarizada, a produção de ROS aumenta e o seu ambiente intracelular torna-se mais oxidado, aumentando a sua agressividade tumoral.
URI: http://hdl.handle.net/10348/8800
Tipo de Documento: Dissertação de Mestrado
Aparece nas colecções:DQUI - Dissertações de Mestrado
TD - Dissertações de Mestrado

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
AndreiaFernandes.pdf2,26 MBAdobe PDFThumbnail
Ver/Abrir


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex mendeley Endnote Logotipo do DeGóis Logotipo do Orcid 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.