Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10348/8811
Título: Molecular and Functional Characterization of a Satellite Non-Coding RNA – FA-SAT – a Key Player of Cycling Cells
Autor: Ferreira, Daniela Perneta
Orientador: Chaves, Raquel Maria Garcia Dos Santos
Adega, Maria Filomena Lopes
Santos, Elsa Clara Carvalho Logarinho
Palavras-chave: FA-SAT DNA
FA-SAT RNA
PKM2
via mitogénica
apoptose
tumorigénese
Data: 19-Jan-2018
Resumo: Satellite DNA (satDNA) sequences are part of an extensive, ubiquitous and usually dynamic/variable genome fraction, and were considered for many years as being transcriptionally repressed. Recent evidence have demonstrated that satDNA is actually transcribed in the form of satellite non-coding RNAs (satncRNAs). Different functions have been assigned to these satncRNAs uncovering important roles not only in normal cell processes, but also in pathological conditions such as cancer. However, the knowledge about satDNA sequences other than (peri)centromeric satDNAs, their transcription and functions remain largely unknown. Besides FA-SAT being the major satDNA family of the cat genome (primarily located at the telomeres), FA-SAT-related sequences were identified in other mammalian genomes. To gain more insight on this repetitive sequence, a wider range of genomes has been analysed for its presence, and given the conservation found in diverse Bilateria species, grant it the classification of the oldest satDNA ever reported. Furthermore, and importantly, FA-SAT is transcribed in all these genomes. The conservation of FA-SAT DNA and the presence of its transcripts in all these genomes raised the hypothesis on its functionality. This assumption was the basis for the following works. A cellular characterization of the FA-SAT satncRNAs proved that these are nuclear transcripts and that they play their function(s) at the G0/G1 phase. Using an interactomic approach, we demonstrated that FA-SAT RNA interacts with PKM2, a moonlight protein that acts at the cytoplasm as a pyruvate kinase and at the nucleus as a protein kinase. Functional assays conducted subsequently revealed that the disruption of the FA-SAT RNA/PKM2 complex, either by FA-SAT RNA or PKM2 silencing, induces apoptosis. Moreover, MYC RNA also decreases with FA-SAT RNA depletion. Thus, we uncover FA-SAT RNA as a player of the mitogenic pathway that recruits PKM2 to the nucleus, as shown both in cat and human cells. The fact that these pathways are involved in several hallmarks of cancer, raised the question whether FA-SAT RNA has a role in tumourigenesis. To ascertain this, we used the different passages of a well-characterized feline mammary tumour cell line–FkMTp as a tumour progression in vitro model. Copy number variation, FA-SAT RNA level (both long and small) and DNA methylation status were the parameters analysed, allowing to conclude that FA-SAT RNA cellular levels are not influenced by DNA copy number variation but ratherby the methylation status of the sequences. However, this does not seem to be the only regulatory mechanism involved in the transcription regulation of this satncRNA. FA-SAT silencing carried out in FkMTp cells induced apoptosis and a decrease in PKM2 and MYC transcripts. Furthermore, ERBB2 RNA levels were also analysed in FA-SAT depleted cells and a similar decrease was observed. As FA-SAT satncRNAs were detected in mitosis in FkMTp cells, a study was carried out to disclose a putative FA-SAT RNA/PKM2 protein complex influence in the cell response to antimitotic drugs. Thus, different passages of the FkMTp cell line were characterized regarding cell fate in response to taxol, nocodazole and vinblastine, presenting different behaviours when exposed to each of these spindle poisons. Interestingly, we found the FASAT RNA/PKM2 complex to be involved in the resistance to taxol. Also, the disruption of this complex by PKM2 repression seems to influence the sensitivity to nocodazole. These results strongly point to the effect of this complex in the cell response to antimitotic chemotherapy. The FA-SAT study was extended to a collection of 27 feline mammary tumours, using the disease-free tissue counterpart as reference. It was possible to found a relation between FA-SAT DNA and RNA levels with different clinical parameters. ERBB2 DNA and RNA levels were positively correlated with FA-SAT DNA and RNA, respectively. Also, FA-SAT RNA was associated with MYC RNA levels. Our data suggests FA-SAT RNA as a potential cancer biomarker. FA-SAT RNAs display an important and conserved function in cat and human genomes, either in tumour or non-tumour cells. In fact, this work uncovered FA-SAT RNAs as key players in the apoptotic and mitogenic pathways. Furthermore, we found the function of FA-SAT RNA to be carried out through its interaction with PKM2 protein, stablishing the FASAT RNA/PKM2 complex, as a potential target for cancer therapy, as its disruption induces apoptosis.
As sequências de DNA satélite (satDNA) fazem parte de uma significativa, ubíqua dinâmica e variável fração dos genomas. Apesar de terem sido consideradas durante muitos anos como transcripcionalmente reprimidas, evidências recentes demonstram que, na realidade, estas sequências são transcritas, originando RNAs satélite não-codificantes (satncRNAs). Diferentes funções têm vindo a ser-lhes atribuídas, nomeadamente no funcionamento normal da célula, mas também no cancro. Porém, o conhecimento no que diz respeito às sequências de satDNA não-(peri)centroméricas, à sua transcrição e às suas funções é escasso, tornando urgente a sua investigação. Apesar do FA-SAT ser a principal família de satDNA do genoma do gato (localizado primariamente nos telómeros), foram já identificadas sequências homólogas ao FA-SAT em outros mamíferos. De forma a obter mais informações sobre esta sequência repetitiva, uma série de genomas diferentes foram analisados no que diz respeito à sua presença. A elevada conservação do FA-SAT observada em espécies da clade Bilateria, confere-lhe a classificação do mais antigo satDNA descrito até ao momento. Mais ainda, o FA-SAT é transcrito em todos esses genomas. A conservação e a transcrição deste satDNA em genomas filogeneticamente afastados colocaram a hipótese da sua funcionalidade. Este pressuposto foi a base para os trabalhos que se seguiram. A caracterização celular do FA-SAT satncRNA mostrou a sua localização no núcleo onde desempenha as sua(s) função(ões) na fase G0/G1. Através de um ensaio de interatómica, provamos que o FA-SAT RNA interage com a proteína PKM2, que atua no citoplasma como piruvato cinase e no núcleo como proteína cinase. Os ensaios funcionais realizados revelaram que a disrupção do complexo FA-SAT RNA/PKM2, seja pelo silenciamento do FA-SAT RNA ou do PKM2, resulta em apoptose, havendo diminuição dos níveis de RNA do MYC. Assim, descobrimos um interveniente da via mitogénica, o FA-SAT RNA, que recruta a proteína PKM2 para o núcleo, permitindo assim que esta exerça a sua função, tanto em células de gato como humanas. Como estas vias estão envolvidas em várias “hallmarks” do cancro, tornou-se essencial descortinar o envolvimento do FA-SAT RNA na tumorigénese. Assim, estudamos o FA-SAT RNA em diferentes passagens da linha celular de tumor mamário de gata-FkMTp, como modelo de progressão in vitro. A variação do número de cópias, os níveis de FA-SAT RNA e o estado de metilação do DNA foram os parâmetros analisados para provar que os níveis de transcritos FA-SAT não são influenciados pela variação do número de cópias do DNA, mas sim pelo estado de metilação das sequências. Porém, este não parece ser o único mecanismo de regulação envolvido na sua transcrição. Os estudos funcionais para o silenciamento do FA-SAT realizados em células FkMTp também resultaram em apoptose e na diminuição dos níveis do RNA do PKM2 e MYC. Adicionalmente, os níveis de RNA do ERBB2 também foram analisados em células onde o FA-SAT foi silenciado, observando-se uma diminuição semelhante. Como os FA-SAT RNAs foram detectados em mitose em células FkMTp, foi realizado um estudo para desvendar a influência do complexo FA-SAT RNA/PKM2 na resposta celular a quimioterápicos anti-mitóticos. Assim, diferentes passagens da linha celular FkMTp foram caracterizadas em relação ao seu fenótipo celular quando expostas ao taxol, ao nocodazole e à vinblastina, apresentando diferentes comportamentos. A análise global de diferentes intervenientes indica que o complexo FA-SAT RNA/PKM2 está envolvido na resistência ao taxol. Além disso, a disrupção deste complexo pela diminuição da PKM2 parece influenciar a sensibilidade ao nocodazole. Estes resultados sugerem assim a influência deste complexo na resposta celular à quimioterapia com anti-mitóticos. O estudo do FA-SAT foi alargado a uma coleção de 27 tumores mamários de gata, tendo sido utilizado o tecido sem lesão do mesmo individuo como referência. Foi possível relacionar os níveis de FA-SAT (DNA e RNA) com diferentes parâmetros clínicos. Os níveis de ERBB2 (DNA e RNA) estão positivamente correlacionados com os níveis de FA-SAT (DNA e RNA, respetivamente). Além disso, o FA-SAT RNA está associado aos níveis de RNA do MYC. Os nossos dados indicam que o FA-SAT RNA pode ser um potencial biomarcador de cancro. Este trabalho revelou que o FA-SAT RNA desempenha uma função importante e conservada nos genomas de gato e humano, tanto em células tumorais como não-tumorais, sendo um importante interveniente das vias apoptótica e mitogénica. A função do FA-SAT RNA é realizada através da sua interação com a proteína PKM2, formando o complexo FASAT RNA/PKM2, sendo este um potencial alvo para a terapia do cancro, uma vez que sua disrupção resulta em apoptose.
URI: http://hdl.handle.net/10348/8811
Tipo de Documento: Tese de Doutoramento
Aparece nas colecções:DGB - Teses de Doutoramento
TD - Teses de Doutoramento

Ficheiros deste registo:
Ficheiro Descrição TamanhoFormato 
PhD_Thesis_Daniela_Ferreira_final.pdf
  Until 2021-01-20
12,06 MBAdobe PDFVer/Abrir Request a copy


FacebookTwitterDeliciousLinkedInDiggGoogle BookmarksMySpace
Formato BibTex mendeley Endnote Logotipo do DeGóis Logotipo do Orcid 

Todos os registos no repositório estão protegidos por leis de copyright, com todos os direitos reservados.